張洪斌，劉明艷，田玉敬，胡雪芹

(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230009)

微生物來源的昆蟲幾丁質(zhì)酶抑制劑的篩選與分離純化

張洪斌，劉明艷，田玉敬，胡雪芹

(合肥工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230009)

通過對篩選條件進(jìn)行優(yōu)化，建立可靠的平板透明圈初篩方法和DNS比色復(fù)篩方法；以棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶作為篩選靶標(biāo)并用此篩選模型對500多株菌株進(jìn)行篩選，篩選出包括A0901#菌株在內(nèi)的具有幾丁質(zhì)酶抑制作用的活性菌株29株。采用活性追蹤的方法對A0901#菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過乙醇沉淀、Sevag試劑除蛋白及Sephadex G-100凝膠色譜得到一個純的活性物質(zhì)，經(jīng)HPLC檢測顯示在保留時間15min左右為一單峰，DNS比色法驗證其抑制率為54.2%，紅外、質(zhì)譜、元素分析表明此物質(zhì)的分子式為C9H18O10，并證明其為一個多羥基的化合物。

幾丁質(zhì)酶；抑制劑；篩選；分離

幾丁質(zhì)酶廣泛存在于各種微生物、動物和植物中，尤其在真菌和昆蟲等的生長、繁殖和發(fā)育過程中起著重要作用[1]。幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)，轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生菌體蛋白和氨基寡糖素等產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥、化妝及動物飼料等行業(yè)廣泛應(yīng)用[2]。在昆蟲體內(nèi)，幾丁質(zhì)酶在其胚后發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色，尤其在幼蟲蛻皮和化蛾階段；另外幾丁質(zhì)酶還涉及擴(kuò)大和降低中央腸圍食膜基質(zhì)，保護(hù)中央腸上皮組織[3]。由于昆蟲的生長和發(fā)育嚴(yán)格地依靠其改變自身幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的能力，昆蟲以高度控制的方式重復(fù)合成和降解幾丁質(zhì)以達(dá)到允許蛻皮和圍食膜的再生[4-5]，因此阻斷在幾丁質(zhì)降解中的關(guān)鍵酶——幾丁質(zhì)酶是理想的新型生物農(nóng)藥篩選模型。通過阻斷幾丁質(zhì)酶，阻止昆蟲蛻皮、化蛾和圍食膜的再生，以達(dá)到殺滅昆蟲的目的。而且由于幾丁質(zhì)不存在于脊椎動物中，因而該類藥劑對人畜較為安全，因此幾丁質(zhì)酶抑制劑可以開發(fā)成為一種新型的綠色生物殺蟲劑[6]，它對人畜安全無毒，不污染環(huán)境，不破壞農(nóng)作物的色香味，可應(yīng)用于作物生長的的任何時期，是食品安全的重要保證。

雖然近年來幾丁質(zhì)合成酶抑制劑如真菌多氧霉素都已經(jīng)上市，但是關(guān)于幾丁質(zhì)酶抑制劑的報道還很少。迄今為止，世界上關(guān)于幾丁質(zhì)酶抑制化合物的相關(guān)研究大致經(jīng)歷了3個發(fā)展階段：第一階段是從微生物代謝產(chǎn)物中篩選作為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和抗真菌劑的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，并就其對昆蟲和真菌生命活動產(chǎn)生的影響進(jìn)行了深入研究，這個階段以阿洛菌素的發(fā)現(xiàn)和對其生物合成機制的探討為標(biāo)志；第二階段是對幾丁質(zhì)酶抑制劑與幾丁質(zhì)酶之間相互作用進(jìn)行的結(jié)構(gòu)學(xué)研究，這為人工設(shè)計幾丁質(zhì)酶抑制劑奠定了堅實的基礎(chǔ)，這個階段對精氨芬、阿爾加定與幾丁質(zhì)酶相互作用方式和空間結(jié)構(gòu)的闡明為標(biāo)志；目前，該領(lǐng)域的研究已經(jīng)從篩選新的幾丁質(zhì)酶抑制劑發(fā)展到建立新的篩選模型和發(fā)現(xiàn)已知幾丁質(zhì)酶抑制劑的新功能[7]。到目前為止，已報道的幾丁質(zhì)酶抑制劑有阿洛菌素(allosamidin)[8]、酪氨酸衍生物類、生物堿類、環(huán)二肽(CI-4)、精氨芬(argifin)[9]、阿爾加定(argadin)[10]、甲基黃嘌呤藥物及其衍生物、核黃素和黃素衍生物等[11]。抑制劑的來源存在于微生物、植物中，如1983 年從非洲醫(yī)用植物藍(lán)茉莉(Plumbago capensis) 中提取出的plumbagin (2-甲基-5-羥基-1,4-萘醌)能抑制4種農(nóng)業(yè)鱗翅目昆蟲的蛻皮[12]。

由于幾丁質(zhì)酶抑制劑獨特的作用機制，人們利用幾丁質(zhì)酶抑制劑進(jìn)行病蟲害防治、醫(yī)藥生產(chǎn)、飼料加工的研究已越來越受到重視。本研究直接從棉鈴蟲蛹中提取酶，建立以平板透明圈初篩法和DNS比色法為復(fù)篩的篩選方法，從我國豐富的微生物資源中獲得幾丁質(zhì)酶抑制化合物的生產(chǎn)菌株，并對其中的活性物質(zhì)進(jìn)行初步的分離，以期從中發(fā)現(xiàn)對幾丁質(zhì)酶具有良好抑制作用的化合物，為開發(fā)具有新型作用點的殺蟲抗真菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

棉鈴蟲購于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；菌種均由本實驗室篩選保存；Sephadex G-100為Pharmacia公司產(chǎn)品；其他常用試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌)和高氏一號培養(yǎng)基(培養(yǎng)放線菌)。

1.1.3 幾丁質(zhì)抑制化合物的篩選平板

1%膠體幾丁質(zhì)8g，瓊脂粉1.5～2g，水100mL，pH7.0。

1.1.4 儀器與設(shè)備

1515型高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀 Waters公司；傅里葉紅外光譜儀 Thermo Nicolet公司；WFZ800-D38紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；KDC-160H高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；EURO EA 3000元素分析儀 Leeman公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)的配置

稱取2g幾丁質(zhì)，加入20mL 85g/100mL質(zhì)量濃度的濃磷酸溶解，常溫下放置2d后，加蒸餾水稀釋，反復(fù)沖洗(采用離心分離)至pH5.0以上。離心后的幾丁質(zhì)沉淀用蒸餾水調(diào)整終質(zhì)量濃度至1g/100mL[13]。

1.2.2 粗酶液的提取

將棉鈴蟲蛹于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10d至快要化蛾時，收集蛹于0.1mol/L、pH6.0磷酸緩沖液中均質(zhì)，冰水浴中超聲1s，間歇2s，150W破碎16min，4℃、10000r/min離心30min收集上清[14]。

1.2.3 酶活力測定

以N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生成速度測定酶活性大小。50℃，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，每小時產(chǎn)生1μmol/LN-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)[15]。

膠體幾丁質(zhì)＋幾丁質(zhì)酶→N-乙酰-D-氨基葡萄糖

在裝有預(yù)熱至45℃的0.5mL 1g/100mL膠體幾丁質(zhì)和0.5mL 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)比色管中，加入0.5mL酶液，于50℃溫育1h，沸水浴保持10min中止反應(yīng)，將沸水浴后的酶液置于冰浴冷卻，冷卻后加入1.5mL DNS試劑，沸水浴20min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容到25mL，搖勻，離心后取上清，以滅活的等量酶液做空白對照，在波長500nm處測吸光度，折算成酶活。

1.2.4 活性菌株的液體培養(yǎng)方法

活化后的菌株接種于液體培養(yǎng)基，細(xì)菌37℃振蕩培養(yǎng)2d，放線菌30℃振蕩培養(yǎng)5d，培養(yǎng)液6000r/min 離心10min，取上清。

1.2.5 平板透明圈法

把酶液與篩選待測液按1:2 的比例混合，在幾丁質(zhì)酶抑制化合物篩選平板上打孔[16]，取混合液30μL加樣于孔中，觀察平板透明圈的大小。在檢測過程中以緩沖液系統(tǒng)作為陰性對照、緩沖液酶液系統(tǒng)作為陽性對照。

1.2.6 DNS比色法

在酶反應(yīng)體系中加入待測液，測定剩余酶活，以滅活后的體系和原酶反應(yīng)體系作為對照，根據(jù)酶活是否下降以及下降的程度來判定抑制性。幾丁質(zhì)酶抑制物的抑制活性可以用抑制率來計算：

測試組1：500μL膠體幾丁質(zhì)加入500μL酶液和1500μL pH 6.0磷酸緩沖液，在50℃進(jìn)行酶促反應(yīng)1 h后進(jìn)行測定。

對照組1：500μL膠體幾丁質(zhì)加入500μL酶液和1500μL pH6.0磷酸緩沖液，加樣后立即沸水浴10min滅酶活，和其他組一起測定。

測試組2：500μL膠體幾丁質(zhì)加入500μL酶液、1000μL培養(yǎng)液和500μL pH6.0磷酸緩沖液，在50℃進(jìn)行酶促反應(yīng)1h后進(jìn)行測定。

對照組2：500μL膠體幾丁質(zhì)加入500μL酶液、1000μL培養(yǎng)液和500μL pH6.0磷酸緩沖液，加樣后立即沸水浴10min滅酶活，和其他組一起測定。

測試組1與對照組1的吸光度差值為ΔA1，測試組2與對照組2的吸光度差值為ΔA2，測定后按公式(1)計算抑制率。

1.2.7 活性物質(zhì)的初步篩選

將發(fā)酵液抽濾取上清，加入3倍體積無水乙醇進(jìn)行醇沉處理，4℃冰箱過夜。醇沉過夜的發(fā)酵液在6000r/min離心20min，沉淀用熱蒸餾水溶解，加入Sevag試劑除蛋白(加入比例為發(fā)酵液與Sevag試劑體積比4:1；Sevag試劑配比為氯仿與正丁醇體積比4:1)。

提取液濃縮后加樣到已平衡的Sephadex G-100凝膠過濾柱(2.0cm×80cm)，用二蒸水洗脫，流速20mL/h，每5mL收集一管，采用DNS比色法及HPLC法檢測確定活性流分區(qū)域。色譜條件如下：GPC分離柱(7.8mm×300mm)，2414型示差折光檢測器；流動相為純水，流速0.6mL/min；檢測器溫度40℃，柱溫度60℃。

1.2.8 活性物質(zhì)的初步鑒定

收集活性流分經(jīng)冷凍干燥機凍成粉末。將此純品送分析測試中心進(jìn)行紅外檢測、元素分析和質(zhì)譜檢測。

紅外條件：KBr壓片，常溫(25℃)下測試。質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度230℃；電離能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；溶劑延遲3min；掃描質(zhì)量范圍：20～500u，掃描間隔0.2s。

元素分析條件：EURO EA 3000元素分析儀上測得。

1.2.9 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

將活性物質(zhì)粉末分別用乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、DMSO、氘代DMSO、氘水等試劑溶解，驗證活性成分的溶解性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在一定范圍內(nèi)，還原糖N-乙酰-D-氨基葡萄糖的量與DNS液顯色后的吸光度呈正線性關(guān)系，在500nm波長處測定N-乙酰-D-氨基葡萄糖的吸光度，利用吸光度可測知樣品的含糖量，得到酶活力。

式中：k為N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，1.1356；n為酶液稀釋倍數(shù)；M為N-乙酰-D-氨基葡萄糖相對分子質(zhì)量，221.2；t為酶反應(yīng)時間/h。

由酶活力與A500nm值的轉(zhuǎn)化公式可得，從棉鈴蟲蛹提取到的粗酶液的酶活力為14.65U/mL。

2.2 活性菌株的篩選

圖1 平板透明圈示意圖Fig.1 Schematic diagram of transparent plate for screening strains

表1 活性菌株篩選的相關(guān)實驗參數(shù)Table 1 Results of screening for anti-chitinase strains

本研究利用平板透明圈法和DNS比色法從500多株菌中篩選出具有幾丁質(zhì)酶抑制作用的活性菌共29株菌株(其中細(xì)菌11株，放線菌18株)。

幾丁質(zhì)酶抑制化合物篩選平板含有膠體幾丁質(zhì)和瓊脂。在平板上打孔加入酶液，幾丁質(zhì)酶能分解平板中的膠體幾丁質(zhì)而產(chǎn)生透明圈。用相同量的酶液與檢測液混合時、透明圈變小表明酶的活性受到抑制、透明圈越小表明受抑制的程度越高。由圖1可知，平板透明圈法篩選幾丁質(zhì)酶抑制物快捷、直觀，所以在粗篩的過程中采用此模型。表1是各活性菌株初篩、復(fù)篩的相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.3 A0901#放線菌活性物質(zhì)的分離純化

采用活性追蹤的方法對A0901#菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。經(jīng)乙酸乙酯、醇沉分別處理后，檢測得出發(fā)酵液在乙酸乙酯萃余相和醇沉處理相有活性(表2)，經(jīng)Sevag試劑除蛋白和Sephadex G-100凝膠過濾層析后的流分經(jīng)高效液相色譜檢測得到一個保留時間為15min左右的峰(圖2)，DNS活性檢測驗證證明此流分有活性，根據(jù)保留時間表明分子質(zhì)量不是很大；DNS檢測其抑制率為54.2%，有抑制性(表3)。

表2 DNS法測得A0901#菌各相活性Table 2 Inhibition rates of fractions of fermentation broth of strain A0901# separated by different methods on chitinase

圖2 活性物質(zhì)流分HPLC圖Fig.2 HPLC separation of chitinase inhibitor in the alcohol precipitate of fermentation both of strain A0901#

表3 DNS法測活性物質(zhì)流分A500nm值和抑制率Table 3 Inhibition rate of the active peak obtained from HPLC separation on chitinase

2.4 活性物質(zhì)的初步解析

IR譜圖的3300cm-1處有吸收，表明有羥基存在(圖3)；MS譜圖顯示活性物質(zhì)的相對分子質(zhì)量為279(圖4)；元素分析結(jié)果顯示C、H比為1:2(表4)，結(jié)合上述數(shù)據(jù)可以確定活性物質(zhì)的分子式為C9H18O10。

圖3 活性物質(zhì)紅外譜圖Fig.3 IR spectrum of the separated chitinase inhibitor

表4 活性物質(zhì)的元素分析結(jié)果Table 4 Element composition of the separated chitinase inhibitor

2.5 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

用等量的丙酮、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、氘水、DMSO和氘代DMSO進(jìn)行溶解實驗，僅僅只有DMSO和氘代DMSO能溶解此活性物質(zhì)；用氯仿溶解時，活性物質(zhì)在溶液中形成絮狀沉淀，在甲醇、丙酮溶液中則完全不溶。

3 討 論

研究幾丁質(zhì)酶抑制劑，不僅對于深入研究幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能，為研究幾丁質(zhì)酶的催化機制提供理論基礎(chǔ)也可為研發(fā)新型的殺菌劑、殺蟲劑、抗感染等化療藥物提供新的導(dǎo)向，對農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥的發(fā)展將具有重要意義而且還可以在此基礎(chǔ)上人工設(shè)計其類似物作為幾丁質(zhì)酶抑制劑，也可以為深入闡釋幾丁質(zhì)酶抑制劑的抑制機制奠定基礎(chǔ)。

圖4 活性物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.4 Mass pectrum of the separated chitinase inhibitor

目前，幾丁質(zhì)酶抑制劑活性的檢測方法有：利用同位素標(biāo)記的放射性測定法；與顯色底物作用的比色測定方法等[17]。其中利用同位素測定的放射性測定法過程復(fù)雜，因而不適用于大規(guī)模的藥物篩選?；谂c顯色底物作用的比色法，反應(yīng)過程簡單，操作方便，適用于大規(guī)模藥物篩選模型應(yīng)用。

本篩選模型中酶為從棉鈴蟲蛹中提取的粗酶，以此為底物篩選出的幾丁質(zhì)酶抑制劑更符合生產(chǎn)生活中的實際應(yīng)用。本實驗初篩的檢測方法為平板透明圈法，方法操作簡便、靈敏，為大規(guī)模篩選幾丁質(zhì)酶抑制劑提供了保障。復(fù)篩采用DNS比色法，操作簡便、穩(wěn)定，排除初篩時有可能造成的誤差及有顏色發(fā)酵液造成的干擾，計算時將本底扣除。實驗篩選出具有較強抑制幾丁質(zhì)酶活性的微生物菌株29株，該酶抑制劑能有效抑制棉鈴蟲蛹幾丁質(zhì)酶活性。

目前比較有效的幾丁質(zhì)酶抑制劑主要還是allosamidin和環(huán)五肽 (argifin和argadin)等天然化合物，因為它們都是屬于在納摩爾濃度下就能有效發(fā)揮抑制作用的酶抑制劑。阿洛菌素是由2分子N-2-乙?；?2-D-2-氨基阿洛糖和1分子氨基環(huán)戊醇衍生物構(gòu)成的擬三糖化合物，在納摩爾水平上能有效抑制屬于糖苷水解酶第18家族的幾丁質(zhì)酶，但對屬于糖苷水解酶第19家族的幾丁質(zhì)酶沒有抑制作用。精氨芬和阿爾加定是水溶性的環(huán)五肽。精氨芬的肽基化精氨酸殘基在與18家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，它能在納摩爾-毫摩爾水平上對18家族幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生抑制作用[10]。

本研究在建立簡便、快速幾丁質(zhì)酶抑制化合物的檢測方法(平板透明圈法和DNS比色法) 的基礎(chǔ)上，從土壤中篩選到放線菌A0901#。該菌株的次級代謝產(chǎn)物中含有幾丁質(zhì)酶抑制化合物。在對該幾丁質(zhì)酶抑制化合物性質(zhì)初步探索的過程中發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)是水溶性化合物，乙醇醇沉可將其分離，不溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、氘水等有機試劑，紅外檢測顯示是多羥基的化合物，質(zhì)譜和元素分析結(jié)果推斷出此活性物質(zhì)的分子式。從以上的研究結(jié)果可以初步推斷放線菌A0901#次級代謝產(chǎn)物中的幾丁質(zhì)酶抑制化合物是糖類物質(zhì)。關(guān)于該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析和其相關(guān)理化性質(zhì)工作尚在進(jìn)行中。這些都為進(jìn)一步篩選出有抑制作用的化合物，從而把它開發(fā)成一種實用性較強的生物農(nóng)藥，用于防治真菌、線蟲及昆蟲性病害提供參考。

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Screening and Purification of Insect Chitinase Inhibitor of Microbial Origin

ZHANG Hong-bin，LIU Ming-yan，TIAN Yu-jing，HU Xue-qin
(School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Helicoverpa armigerachitinase was used as the target to screen strains able to inhibit chitinase by transparent ring plate screening method and DNS colorimetric screening method. A total of 29 strains including strain A0901#were selected out of 500 ones. For separation and purification, the fermentation products of strain A0901#were subjected to alcohol precipitation,protein removal by Sevag s method and gel filtration chromatographic fractionation, and a pure bioactive material was obtained.This bioactive material exhibited a single HPLC peak with a retention time of 15 min. Its inhibition rate on chitinase was evaluated by DNS colorimetric method to be 54.2%. Moreover, its formula was C9H18O10 according to the IR and mass and element analyses, and its nature also proved a multiple hydroxyl compound.

chitinase；inhibitor；screening；isolation

Q939.97

A

1002-6630(2010)23-0271-05

2010-09-14

安徽省國際科技合作項目(08080703017)；國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目 (091035945)

張洪斌(1970—)，男，副教授，博士，研究方向生物化工與酶工程。E-mail：zhb5678@163.com