劉偉民，徐立平，郭春梅，楊鎖華，張 建，趙杰文

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

灰樹花在米糠培養(yǎng)基上固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)多糖研究

劉偉民，徐立平，郭春梅，楊鎖華，張 建，趙杰文

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

為高效利用稻谷加工副產(chǎn)品米糠并擬在固態(tài)發(fā)酵設(shè)備中發(fā)酵生產(chǎn)多糖保健食品，以米糠為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對灰樹花固態(tài)發(fā)酵米糠產(chǎn)多糖條件進(jìn)行探索。針對定量米糠，選取水分、蛋白胨、葡萄糖和pH值影響因素，以總多糖含量為評價指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，按L16(45)的正交試驗(yàn)方案得到優(yōu)化培養(yǎng)基，并進(jìn)一步通過單因素試驗(yàn)選擇得到較優(yōu)的固態(tài)發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明：優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基組成為原始米糠(水分為65%，按原始米糠質(zhì)量計(jì))、蛋白胨0.5%、葡萄糖4%、pH5.5、裝樣量20g/250mL三角瓶，發(fā)酵條件為：接種量10%、培養(yǎng)溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速170r/min、培養(yǎng)時間11d，多糖得率以米糠為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，可達(dá)4.52%。用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，得到表征多糖產(chǎn)量和培養(yǎng)基成分關(guān)系的回歸方程。

灰樹花；米糠培養(yǎng)基；固態(tài)發(fā)酵；灰樹花多糖；回歸模型

灰樹花(Grifola frondosa)是一種珍稀的食、藥兼用真菌[1-3]，它富含維生素、真菌多糖，并可用于富集鋅、鈣、磷、鐵、硒等多種對人體有益的礦物質(zhì)，因而可以用于生產(chǎn)健康食品和醫(yī)療保健品[4-8]。固態(tài)發(fā)酵具有對環(huán)境污染小，單位體積內(nèi)獲得產(chǎn)物多等優(yōu)點(diǎn)，有其應(yīng)用價值。本單位自主研發(fā)了轉(zhuǎn)鼓式固態(tài)發(fā)酵設(shè)備，具有良好的效果，希望進(jìn)一步開發(fā)出適用工藝。米糠作為稻谷加工過程中的副產(chǎn)品[9-10]，將其加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其在灰樹花產(chǎn)多糖和富集微量元素的過程中得到利用，使工廠化固態(tài)發(fā)酵在節(jié)約土地使用和提高生產(chǎn)效率的同時，降低生產(chǎn)成本，本研究具有實(shí)用意義[11-15]。采用多項(xiàng)式或線性回歸方法建立固態(tài)發(fā)酵模型，可更清楚揭示研究目標(biāo)和影響因素之間的定量關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

灰樹花菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；米糠由鎮(zhèn)江市米廠提供；所用試劑均為分析純。

HANGPING JA2003電子天平 上海儀器儀表廠；SHJ CA-480-Ⅱ超凈工作臺 上海匯龍公司；數(shù)顯生化培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；DH2-D冷凍恒溫振蕩器 江蘇太倉試驗(yàn)設(shè)備廠；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；WFJ7200可見光分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 固體培養(yǎng)基的配制

稱取定量米糠放入250mL的三角燒瓶中，按米糠的質(zhì)量為基準(zhǔn)計(jì)算出加入的水分和外加的碳源、氮源后搖勻，0.1MPa高壓滅菌30min。原始米糠中所含米糠多糖經(jīng)測定含量較低，未做提取，供灰樹花在生長中作為營養(yǎng)物質(zhì)使用并轉(zhuǎn)化掉。

1.2.2 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)，250mL三角燒瓶中裝入60%水分的含15g原始米糠的固體培養(yǎng)基，25℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min、10%的接種量、培養(yǎng)7d。

正交試驗(yàn)的原始米糠裝樣量4.5g、接種量10%、轉(zhuǎn)速150r/min、溫度25℃、發(fā)酵時間7d。

發(fā)酵工藝條件的單因素試驗(yàn)參照培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)各條件進(jìn)行。某因素變動時，其他條件不變。培養(yǎng)基為優(yōu)化培養(yǎng)基。

1.2.3 多糖提取[11-14,16-18]及含量測定

將發(fā)酵后的米糠研磨，沸水提取6h，2400r/min離心20min，加耐高溫淀粉酶除淀粉，降溫至60℃，糖化酶除糊精，冷卻，調(diào)節(jié)等電點(diǎn)去除蛋白質(zhì)，3200r/min離心20min，取上清液用乙醇沉淀，離心，得沉淀，苯酚-硫酸法測定總多糖含量。加淀粉酶去除可能存在的少量淀粉，將其降解成糊精和麥芽糖，再在糖化酶的作用下降解成葡萄糖，溶于乙醇被除去。

式中：m為樣品中原始米糠質(zhì)量；m1為多糖質(zhì)量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)水分(50%～75%)、葡萄糖(0～6%)、蛋白胨(0～1.5%)和pH值(3～6)這4個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L16(45)的正交試驗(yàn)，按照正交設(shè)計(jì)“實(shí)用主義”的原則，暫不考慮交互作用，是否有交互作用由回歸方程作基本的解釋。其因素水平如表1所示，原始米糠定量為4.5g，百分比按原始米糠質(zhì)量計(jì)算。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對固態(tài)發(fā)酵的影響

2.1.1.1 外加不同碳源對固態(tài)發(fā)酵的影響

米糠中含有碳源，但是量未必足夠，外加一定的碳源會有助于灰樹花的生長。試驗(yàn)以60%的水分含量米糠固態(tài)培養(yǎng)基分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉及空白試驗(yàn)作對照，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源對多糖含量的影響Fig.1 Effect of carbon resource on the yield of grifolan

由圖1可知，外加碳源對灰樹花在米糠上進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵有一定的影響，外加以上不同的碳源后都比空白的多糖含量有所增加，其中葡萄糖＞淀粉＞乳糖＞蔗糖。故后續(xù)研究選用葡萄糖作為外加碳源。

2.1.1.2 葡萄糖添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響

以60%水分含量米糠固體培養(yǎng)基分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的葡萄糖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄糖添加量對多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glucose content on yield of grifolans

由圖2可知，隨著葡萄糖含量量的增加，多糖的含量也隨之增加，當(dāng)葡萄糖添加量為4%時達(dá)到最大，當(dāng)添加量大于4%時多糖的含量有所減少。為節(jié)省生產(chǎn)耗費(fèi)，可取較小的添加量。

2.1.2 氮源對固態(tài)發(fā)酵的影響

2.1.2.1 外加不同氮源對固態(tài)發(fā)酵的影響

氮源的不同形式是影響灰樹花生長的重要因素之一?；覙浠ㄓ凶约邯?dú)特的酶系，對不同的氮源有不同的利用程度。在60%水分含量，4%葡萄糖米糠固體培養(yǎng)基中分別加入0.5%的蛋白胨、牛肉膏和酵母膏作為外加氮源并與空白對照比較，結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮源對多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen resource on the yield of grifolan

由圖3可知，外加的氮源中，以蛋白胨對米糠固態(tài)發(fā)酵的影響為最大，它們的影響大小依次為蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏，故本研究采用蛋白胨為外加氮源。未考慮其他氮源，原因是試驗(yàn)還是初步性的，首先考慮能生長，將來再做富含氮如麩皮便宜氮源及無機(jī)氮源的深入研究。

2.1.2.2 氮源添加量對固態(tài)發(fā)酵的影響

在60%的水分和4%葡萄糖的米糠固體培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%的蛋白胨，結(jié)果如圖4所示。

圖4 蛋白胨添加量對多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of peptone content on the yield of grifolan

由圖4可知，隨著蛋白胨添加量的增加，米糠固態(tài)培養(yǎng)基的總多糖都隨之增加，達(dá)到1%以后，多糖的增加幅度不大。

2.1.3 水分對固態(tài)發(fā)酵的影響

在4%葡萄糖、1%蛋白胨的米糠固體培養(yǎng)基上，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、55%、60%、65%、70%、75%的水分含量進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，水分含量在60%時灰樹花在米糠上生長最旺盛。水分含量太低不利于酶活和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，然而水分含量太高時不利于空氣的流動。

圖5 水分含量對多糖含量的影響Fig.5 Effect of water content on the yield of grifolan

2.1.4 pH值對發(fā)酵的影響

將4%葡萄糖、1%蛋白胨、60%水分的米糠固態(tài)培養(yǎng)基的起始pH值分別調(diào)至為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH值對多糖含量的影響Fig.6 Effect of pH on the yield of grifolan

由圖6可知，當(dāng)pH值達(dá)到4.5時，多糖得率達(dá)到最大，pH值過大或者過小，都不利于灰樹花在米糠固態(tài)培養(yǎng)基上生長。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

按L16(45)方案，在150r/min，25℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵7d后多糖含量如表2所示。

2.2.2 極差分析

以多糖含量為指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 多糖含量的極差分析結(jié)果Table 3 Rang analysis of orthogonal experiments for the yield of grifolan

由表3可知，4種因素對發(fā)酵的影響大小依次為A＞D＞B＞C，最佳培養(yǎng)基的配方為A4B4C2D3，即水分含量65%、葡萄糖添加量4%、蛋白胨添加量0.5%、pH5.5。

2.2.3 方差分析

以多糖含量為評價指標(biāo)，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 多糖含量的極差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments for the yield of grifola

由表4可知，水分和pH值對多糖含量的影響高度顯著，葡萄糖對多糖含量的影響顯著，蛋白胨的影響不顯著，被合并誤差，故在指定的水平范圍內(nèi)，蛋白胨含量的變化可不考慮。

2.3 固態(tài)發(fā)酵工藝條件的選擇結(jié)果

2.3.1 裝樣量對固態(tài)發(fā)酵的影響

由圖7可知，裝樣量較少時，培養(yǎng)基中含氧量較大，故多糖的得率會較大，但得到的總多糖較低，考慮生產(chǎn)效率選擇20g米糠裝料量。裝樣量超過20g時，培養(yǎng)基中氧含量少，CO2不易排出，多糖得率總體趨勢變低。

圖7 裝樣量對多糖含量的影響Fig.7 Effect of flask-filling volume on the yield of grifolan

2.3.2 接種量對固態(tài)發(fā)酵的影響

圖8 接種量對多糖含量的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the yield of grifolan

由圖8可知，隨著接種量的增加，多糖含量也隨之增加。當(dāng)接種量超過10%時，隨著接種量的增加，水分也隨之增加，使得灰樹花生長受到抑制。綜合考慮接種量和含水率，選擇接種量10%。

2.3.3 發(fā)酵時間對灰樹花固態(tài)發(fā)酵的影響

圖9 發(fā)酵時間對多糖含量的影響Fig.9 Effect of fermentation time on the yield of grifolan

由圖9可知，隨著生長時間增加，發(fā)酵后的固態(tài)米糠培養(yǎng)基的多糖含量有所增加，后期變緩。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇11d作為發(fā)酵時間。

2.3.4 溫度對灰樹花深層固態(tài)發(fā)酵的影響

由圖10可知，隨著溫度的增大，灰樹花的生長增加，在溫度達(dá)到25℃時，灰樹花生長的速度最快。當(dāng)溫度大于25℃時，灰樹花長的速度逐漸減緩。故選擇25℃作為發(fā)酵溫度。

圖10 溫度對多糖含量的影響

Fig.10 Effect of fermentation temperature on the yield of grifolan

2.3.5 轉(zhuǎn)速對灰樹花深層固態(tài)發(fā)酵的影響

圖11 轉(zhuǎn)速對多糖含量的影響

Fig.11 Effect of rotation speed on the yield of grifolan

由圖11可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，多糖含量也隨之增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過170r/min時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，多糖含量增加不多，為了降低機(jī)械功率的輸出，選取170 r/min作為發(fā)酵過程中的搖床轉(zhuǎn)速。

2.3.6 局部尋優(yōu)的發(fā)酵工藝條件

根據(jù)以上試驗(yàn)的結(jié)果，采用局部尋優(yōu)法，選擇較好的發(fā)酵工藝條件是：裝樣量250mL三角瓶裝入20g米糠為基礎(chǔ)的優(yōu)化培養(yǎng)基，10%接種量、溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速170r/min，培養(yǎng)時間11d。以優(yōu)化培養(yǎng)基在所選較優(yōu)的工藝條件下進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖含量(占米糠質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))為4.52%。

2.4 多糖含量和培養(yǎng)基成分關(guān)系回歸模型的求取

為求取固態(tài)發(fā)酵米糠培養(yǎng)基得到的灰樹花多糖含量和培養(yǎng)基組成關(guān)系的模型，利用正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS軟件選擇二次多項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行求取。得到總多糖含量與水分含量A和葡萄糖含量B(其他因素利用SPSS回歸計(jì)算得到的變量系數(shù)的t檢驗(yàn)結(jié)果，判斷無顯著性而剔除)的回歸關(guān)系式為：

擬合的相關(guān)系數(shù)R為0.826，決定系數(shù)R2為0.682，可以認(rèn)為數(shù)據(jù)擬合優(yōu)度較好。對方程的顯著性F值為5.907，P值為0.009，故回歸模型高度顯著。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)時首先假定沒有交互作用，而回歸模型說明有交互作用，所以正交試驗(yàn)的假定有局限性，但如考慮交互作用，需選用更大的正交表，為克服這一不足，可考慮采用求回歸模型的方法進(jìn)一步考察目標(biāo)函數(shù)和變量之間的可能關(guān)系。

3 結(jié) 論

通過對影響培養(yǎng)基的葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、起始水分和pH值4個因素的探索，并且根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到優(yōu)化的米糠固體培養(yǎng)基配方。

對固體培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，得到較優(yōu)的搖瓶條件。多糖得率以米糠為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，可達(dá)4.52%。

采用SPSS軟件，對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到了總多糖與水分含量和葡萄糖含量的回歸關(guān)系式。

[1]汪維云, 吳守一, 朱金華. 灰樹花液體深層培養(yǎng)工藝研究[J]. 生物工程學(xué)報, 1999, 15(3): 378-382.

[2]劉偉民, 黃達(dá)明, 陳庶來, 等. 灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].食品科學(xué), 2003, 24(3): 99-102.

[3]黃達(dá)明, 吳其飛, 陸建明, 等. 固態(tài)發(fā)酵技術(shù)及其設(shè)備的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2003, 29(6): 87-90.

[4]JUNG K, KIM I H, HAN D A. Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice[J]. Journal of Ethnopharmacology,2004, 93: 75-81.

[5]MAU J L, CHANG C N, HUANG S J, et al. Antioxidant properties of methanolic extracts fromGrifola frondosa,Morchella esculentaandTermitomyces albuminosusmycelia[J]. Food Chemistry, 2004, 87:111-118.

[6]LIN H, SHE Y H, CASSILETH B R, et al. Maitake beta-glucan MD-fraction enhances bone marrow colony formation and reduces doxorubicintoxicityin vitro[J]. International Immunopharmacology,2004, 4(1): 91-99.

[7]HSIEH C, WANG H L, CHEN C C, et al. Effect of plant oil and surfactant on the production of mycelial biomass and polysaccharides in submerged culture ofGrifola frondosa[J]. Biochemical Engineering Journal , 2008, 38: 198-205.

[8]YANG B Y, GU Y A, JEONG Y T, et al. Chemical characteristics and immuno-modulating activities of exo-biopolymers produced byGrifola frondosaduring submerged fermentation process[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 41: 227-233.

[9]楊鎖華, 劉偉民, 楊小明, 等. 米糠應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 糧食加工與食品機(jī)械, 2006(4): 70-75.

[10]代崢崢, 劉偉民. 猴頭菌發(fā)酵米糠所產(chǎn)多糖的超聲波輔助提取工藝研究[J]. 糧油加工, 2008(3): 100-103.

[11]汪維云. 灰樹花液體深層發(fā)酵培養(yǎng)及微量元素富集作用研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇理工大學(xué), 1999.

[12]胡祥國. 灰樹花液體培養(yǎng)富集硒的研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2005.

[13]楊鎖華. 用灰樹花發(fā)酵米糠制備多糖[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2006.

[14]代崢崢. 猴頭菌液體發(fā)酵及多糖的提取純化研究[D]. 鎮(zhèn)江: 江蘇大學(xué), 2008.

[15]顧慧敏, 劉偉民, 張建.灰樹花液態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化米糠制備多糖的研究[J].糧油加工, 2010(5): 107-110.

[16]胡祥國, 劉偉民, 劉姜, 等. Za、La對灰樹花液體培養(yǎng)菌絲產(chǎn)量的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2005, 26(1): 79-84.

[17]劉偉民, 孫琳潔, 劉姜, 等. 加鑭液體培養(yǎng)灰樹花富集有機(jī)鋅的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 331-334.

[18]馬鶯, 王靜, 牛天驕. 功能性食品活性成分測定[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

Solid Fermentation ofGrifola frondosain Rice Bran Medium for Grifolan Production

LIU Wei-min，XU Li-ping，GUO Chun-mei，YANG Suo-hua，ZHANG Jian，ZHAO Jie-wen
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to effectively exploit rice bran for preparing health food containing polysaccharides through mimic solid fermentation, rice bran was used as the culture medium matrix to explore the effects of water content, peptone, glucose and pH on solid fermentation ofGrifola frondosa. The optimal culture medium and fermentation conditions were explored by single factor and orthogonal experiments on the basis of grifolan productivity. Results indicated that the optimal medium formula was composed of rice bran as solid culture medium matrix with 65% water, 0.5% peptone, 4% glucose (by mass of rice bran) and pH 5.5. The optimal fermentation conditions were 20 g rice bran matrix in a 250 mL fermentation flask, inoculation amount of 10%,fermentation temperature of 25 ℃, rotation speed of 170 r/min and fermentation time of 11 days. The yield of grifolan was 4.52% under the optimal conditions. By calculating with SPSS software, a regression model of total grifolan was achieved.

Grifola；rice bran medium；solid fermentation；grifolan；regression model

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0238-05

2010-09-21

江蘇省社會發(fā)展科技計(jì)劃項(xiàng)目(BS2006037)；江蘇鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)支撐科技項(xiàng)目(NY2008043)

劉偉民(1964—)，男，教授，博士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏研究。E-mail：liuwmwu@ujs.edu.cn