楊曉靜，陳灝，閆海，*，秦波

1.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

2.北京科技大學應用科學學院生物科學技術系，北京100083

納米二氧化鈦和單壁碳納米管對普通小球藻生長的抑制效應

楊曉靜2，陳灝1，閆海2，*，秦波2

1.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

2.北京科技大學應用科學學院生物科學技術系，北京100083

納米材料獨特的理化性質使其得到了廣泛的應用，但其可能帶來的生物安全性問題引起了社會各界的廣泛關注.采用污染物藻類毒性測試的標準實驗方法，研究了納米二氧化鈦（nano-TiO2）和單壁碳納米管（SWCNTs）對普通小球藻（Chlorella vulgaris）生長的抑制效應.結果表明，在0.01～500mg·L-1濃度范圍內，nano-TiO2對普通小球藻的生長沒有明顯的抑制現(xiàn)象，而SWCNTs卻對普通小球藻的生長存在明顯的抑制效應，其96h半效應濃度（96h-EC50）為261.5mg·L-1.光學和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與nano-TiO2相比，SWCNTs能夠發(fā)生凝聚并吸附大量的普通小球藻細胞，因此嚴重抑制了普通小球藻的正常生長.

普通小球藻；納米二氧化鈦；單壁碳納米管；毒性效應

1 引言（Introduction）

20世紀80年代以來，納米技術和納米材料迅速發(fā)展，應用領域不斷擴大，由此帶來的生物安全性已經成為國內外研究的熱點.納米材料是指幾何尺寸達到100nm以下水平，并具有特殊性能的納米效應材料（白春禮，2001）.由于納米材料獨特的理化性質和強度高、電磁學性能好等優(yōu)點，在電子、磁學、光學、生物醫(yī)學、藥學、化妝品、能源、傳感器和催化等領域已被廣泛應用（鄒莉，2004）.納米材料可以通過各種途徑進入環(huán)境及生物體內，構成對環(huán)境和人體健康潛在的影響和風險，因此納米材料的生物學效應和環(huán)境安全問題不可忽視，與之相關的毒理學研究十分重要（朱小山等，2008）.

近年來，國內外已對單壁碳納米管（SWCNTs）、納米二氧化鈦（nano-TiO2）等納米材料的毒性效應進行了深入研究（Nel et al.,2006;Smart et al.,2006;Hurt et al.,2006;汪冰等，2005;諸穎和李文新，2008）.研究表明，SWCNTs不僅可導致大鼠肺組織損傷和肉芽腫的形成（Lam et al.,2004;Warheit et al.,2004），而且可引起小鼠肝臟組織蛋白質的氧化損傷和大鼠主動脈內皮細胞的損傷（趙明明等，2008;林治卿等，2006）.nano-TiO2可導致小鼠肺部組織的纖維化并有可能誘發(fā)肺癌（朱融融等，2006），沉積在肺部的nano-TiO2顆粒在體液和血液的帶動下，可進一步轉運至心臟、肝臟和腎臟等器官，引起相應的毒性癥狀（王江雪等，2008）.

微細藻類作為水生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級生產者，可以通過光合作用固定二氧化碳合成有機物，對整個水生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定具有至關重要的作用.在微細藻類中，小球藻在淡水、海水中均有分布，是人類最早篩選分離出的微細藻類.小球藻具有生態(tài)分布廣和生長周期短等特點，可以作為典型的實驗藻種來直接觀察細胞水平上的中毒癥狀，是較理想的水環(huán)境生態(tài)毒理學研究的實驗生物（謝艷等，2008）.

作為一種新型污染物，納米材料可進入各種受納水體，對水生生態(tài)系統(tǒng)各級生物產生影響.目前有關納米材料對哺乳動物、魚類等高端生物的毒性已有大量研究（Lam et al.,2004;玉曉微等，2009），但對作為水生初級生產力的微細藻類的毒性效應研究報道極少，因此本文初步研究了SWCNTs和nano-TiO2這兩種重要的納米材料對普通小球藻生長的毒性效應，這對于評價納米材料的生態(tài)風險及安全性具有重要的意義.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實驗材料

普通小球藻（Chlorella vulgaris Beij）購自中科院武漢水生生物研究所.nano-TiO2為銳鈦型（粒度為20～30nm），由北京賽特瑞試劑公司提供；SWCNTs（直徑＜2nm，長度0.5～50μm），由深圳市納米港有限公司提供.

2.2 培養(yǎng)條件

采用水生4號培養(yǎng)基（周永欣和章宗涉，1989），初始pH值調為7.0.將小球藻藻種接種到培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次待進入對數(shù)生長期時進行實驗.實驗所用容器為100mL三角瓶，培養(yǎng)量為30mL，每組設3個平行樣.小球藻培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為4000Lux，光暗比12h∶12h.每天搖瓶2次.實驗所用培養(yǎng)基和器皿等均經過121℃、20min高溫高壓滅菌，然后在潔凈工作臺內經過20min的紫外線殺菌后使用.實驗開始后每天定時取樣，在光學顯微鏡放大400倍下通過血球計數(shù)板計數(shù)藻細胞濃度.

2.3 毒性實驗

納米材料各濃度組采用水生4號培養(yǎng)基配制，接種前超聲波充分振蕩.

采用有毒化學品對藻類毒性測試的標準實驗方法，確定納米材料抑制普通小球藻生長的96h半效應濃度（96h－EC50）（周永欣和章宗涉，1989）.nano－TiO2實驗：初始藻密度1.9×106個·mL-1；濃度系列：0、0.01、1、50、100、500mg·L－1；培養(yǎng)時間96h.SWCNTs實驗：初始藻密度2.1×106個·mL－1；初步實驗納米材料初始濃度配制呈幾何級數(shù)增加，根據(jù)96h實驗結果采用直線內插法初步計算出納米材料抑制普通小球藻生長的96h－EC50.正式實驗納米材料的濃度以初步實驗確定的96h－EC50為中心，各向兩邊以等差數(shù)列的形式延伸2個濃度，共1組對照（0mg·L－1）和5組濃度（150、200、250、300、350mg·L－1）進行；培養(yǎng)時間96h.每天定時取樣，在光學顯微鏡放大400倍下通過血球計數(shù)板計數(shù)藻細胞濃度.以藻細胞濃度為指標，采用機率單位法得到納米材料的劑量反應方程，通過此方程計算出96h－EC50，并對計算出的96h－EC50進行X2檢驗.

2.4 電鏡實驗

取培養(yǎng)96h的各實驗組藻液5mL，8000rpm離心10min，棄上清，加入2.5%戊二醛固定2h，8000rpm離心5min，棄上清.用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，每次8000rpm離心5min棄上清，然后加入5mL無菌水，充分混勻，在錫紙上滴加10μL樣品，自然晾干.真空干燥箱內40℃干燥6h.干燥好的樣品用導電膠粘附在電鏡樣品臺上噴碳，在SEM掃描電鏡上進行觀察.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 nano-TiO2對普通小球藻生長的影響

不同nano-TiO2濃度下，普通小球藻生長至96h的藻細胞濃度如圖1所示.由圖1可見，在0.01～500mg·L－1濃度范圍內，nano-TiO2對普通小球藻的生長沒有產生明顯的有規(guī)律性的抑制效應，藻細胞濃度均維持在1.7×106個·mL－1左右.

3.2 SWCNTs對普通小球藻生長的影響

初步實驗采用直線內插法得到SWCNTs抑制普通小球藻生長的96h-EC50約為250mg·L－1，在此基礎上，進一步研究了SWCNTs對普通小球藻生長的抑制效應，結果如圖2所示.由圖可見，隨SWCNTs濃度的升高，普通小球藻藻密度顯著降低（p＜0.05）.當濃度為300mg·L－1時，普通小球藻的生長受到明顯的抑制.

根據(jù)圖2計算得到的SWCNTs濃度對數(shù)（x）、細胞濃度、抑制率和機率單位（y）等指標見表1，將SWCNTs濃度對數(shù)（x）與機率單位（y）進行一元線性回歸，得到如下劑量反應方程：y=2.7733x－1.7042，R2=0.9909.當機率單位為5時，通過上述方程計算得到SWCNTs抑制普通小球藻生長的96h-EC50為261.5mg·L－1.

表1 單壁碳納米管抑制普通小球藻生長的實驗結果Table 1Result of inhibition effect of SWCNTs on the growth of Chlorella vulgaris

為了驗證計算所得到的96h-EC50的可靠性，對上述劑量反應方程進行X2檢驗，結果見表2．查X2表，當自由度為3時，=7．82，而X2計算值為0．59，＞X2，故上述劑量反應方程符合精度要求，計算得到的96h-EC50真實可靠．

3.3 納米材料抑制普通小球藻生長的顯微觀察

為了進一步研究納米材料抑制普通小球藻生長的過程和機理，我們分別在光學和電子顯微鏡下對納米材料和普通小球藻相互作用的現(xiàn)象進行了觀察.在光學顯微鏡放大400倍下，普通小球藻細胞呈圓形分散分布（圖3a），SWCNTs會發(fā)生一定的凝聚形成較大的顆粒（圖3b）.當SWCNTs與普通小球藻同時存在時，發(fā)現(xiàn)在團聚的SWCNTs周圍吸附了大量的普通小球藻細胞，形成了更大的顆粒物（圖3c）.而nano-TiO2基本呈現(xiàn)分散分布且不發(fā)生團聚（圖3d），當與普通小球藻同時存在時，二者也基本呈現(xiàn)分散分布狀態(tài)，沒有形成大顆粒的凝聚現(xiàn)象（圖3e）.

表2 劑量反應方程的X2檢驗Table 2The X2test of the linear dose-response equations

電鏡觀察結果與光學顯微鏡觀察結果基本一致.普通小球藻細胞呈圓形分散分布（圖4a），SWCNTs發(fā)生凝聚形成較大的顆粒（圖4b），當SWCNTs與普通小球藻共存時，在團聚的SWCNTs顆粒周圍吸附了大量的普通小球藻細胞，形成了更大的顆粒物（圖4c）.而nano-TiO2與普通小球藻同時存在時，雖然普通小球藻周圍也存在一些nano-TiO2（圖4d），但基本呈現(xiàn)分散分布，沒有形成由上述兩種物質組成的較大顆粒（圖4c）.因此SWCNTs吸附大量的普通小球藻細胞形成較大的顆粒，影響了普通小球藻的光合作用及代謝可能是SWCNTs對普通小球藻生長抑制程度遠高于nano-TiO2的主要原因.

4 討論（Discussion）

通常認為納米材料的毒性與納米顆粒的粒徑和比表面積有關，粒徑越小，比表面積越大，與細胞接觸的區(qū)域越多，更有利于納米顆粒的吸收和轉運，更容易引起細胞膜結構的改變，納米材料毒性效應也就越大（Teeguarden et al.,2007）.SWCNTs有較大的比表面積，由于其具有獨特的表面化學和電輸運特性，可能引發(fā)電子轉移導致細胞結構損傷、功能紊亂甚至壞死（Lam et al.,2006）.SWCNTs會引起巨噬細胞的染色質濃縮、細胞器縮小、細胞質中小泡縮小變形等現(xiàn)象，并可能與細胞凋亡有關（孟幻等，2006）.另外，SWCNTs表面帶有大量具有強氧化還原性質的電子簇，可能會與細胞表面的載體通道、各種受體結合，使蛋白質的結構發(fā)生變化，導致羰基含量增多；進入細胞的SWCNTs也可能與酶結合使酶失活，還有可能通過二次氧化或還原產生大量的有害自由基從而改變組織內蛋白質的結構，破壞細胞內有序結構和正常的代謝功能（馮晶等，2006）.

nano-TiO2具有很強的吸附能力和良好的光學催化特性，因為納米顆粒大小與生物分子相差不大，其被生物體攝取后很容易進入到細胞中，因此造成毒性效應.Lu等（2003）用nano-TiO2培養(yǎng)大腸桿菌，結果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細胞壁被降解，出現(xiàn)細胞膜損傷，細胞的通透性受到破壞，引起細胞內容物外流，最終導致細胞死亡.目前，對nano-TiO2的生物毒性作用機制尚未完全了解，但其具有的光學催化特性、活性氧簇ROS的產生及體內氧化應激反應的增強可能是其最主要的致毒作用機制（Nel et al.,2006）.當用波長小于400nm的紫外線照射nano-TiO2時，在水溶液環(huán)境下，nano-TiO2顆粒表面會產生具有強氧化能力的自由基-·OH和O2·-，而羥基自由基可以與DNA發(fā)生反應生成8-羥基鳥苷，導致DNA的解旋和氧化損傷，進而抑制細胞的生長（朱融融等，2005）.

雖然納米材料對微生物和動物細胞毒性及機理方面已有大量研究報道，但對生態(tài)系統(tǒng)初級生產力微細藻類的毒性研究方面卻報道很少.本研究通過采用有毒化學品對藻類毒性測試的標準實驗方法，比較了nano-TiO2和SWCNTs對普通小球藻生長的抑制效應，結果表明在500mg·L-1范圍內nano-TiO2對普通小球藻生長的抑制效應不明顯（圖1），而SWCNTs卻可顯著抑制普通小球藻的生長，其96h-EC50為261.5mg·L-1（圖2），SWCNTs對普通小球藻生長的抑制毒性效應遠大于nano-TiO2.進一步通過光學和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2在水體中基本呈現(xiàn)分散分布且不發(fā)生團聚，當與普通小球藻同時存在時，雖然在小球藻細胞周圍也吸附少量的nano-TiO2，但仍然沒有形成大顆粒的凝聚現(xiàn)象（圖3和圖4），因此對普通小球藻的光合作用及代謝影響較小.與之相反，SWCNTs在水體中會發(fā)生凝聚現(xiàn)象形成較大的顆粒，在與普通小球藻共存時，會吸附大量的小球藻進而形成更大的顆粒（圖3和圖4），因此阻礙了普通小球藻吸收光和代謝的效率，進而嚴重抑制了普通小球藻的生長.研究表明，活性氧ROS的生成和氧化應激反應也是碳納米管細胞毒性的重要方式（Nel et al.,2006;Lam et al.,2006），在SWCNTs對小球藻生長抑制過程中ROS和氧化應激是否起作用值得進一步研究.

大量研究表明，納米材料的小尺寸效應和其誘導產生的氧化應激反應是其細胞毒性產生的主要原因（Nel et al.,2006），本研究結果顯示，在一定環(huán)境條件下所形成的顆粒大小及對細胞的吸附作用可能也是影響其細胞毒性效應的原因之一.

Feng J,Xiao B,Chen J C.2006.Influences of nano-materials on bio-body and environment［J］.Journal of Materials Science and Engineering,24（3）:462-465（in Chinese）

Hurt R H,Monthioux M,Kane A.2006.Toxicology of carbon nanomaterials:Status,trends,and perspectives on the special issue［J］.Carbon,44（6）:1028-1033

Lam C W,James J T,McCluskey R,Arepalli S,Hunter R L.2006.A review of carbon nanotube toxicity and assessment of potential occupational and environmental health risks［J］.Critical Reviews in Toxicology,36（3）:189-217

LamCW,JamesJT,McCluskeyR,HunterRL.2004.Pulmonary toxicity of single-wall nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation［J］.Toxicological Sciences,77（1）:126-134

Lin Z Q,Xi Z G,Chao F H,Yang D F,Zhang H S.2006.Study on the oxidative injury of the vascular endothelial cell affected by SWCNT［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,1（4）:362-369（in Chinese）

Lu Z X,Zhou L,Zhang Z L,Shi W L,Xie Z X,Xie H Y,Pang D W,Shen P.2003.Cell damage induced by photocatalysis of TiO2thin films［J］.Langmuir,19（21）:8765-8768

Meng H,Chen Z,Zhao Y L.2006.Biological effects of some nanomaterials［J］.Basic&Clinical Medicine,26（7）:699-703（in Chinese）

NelA,XiaT,M?dlerL,LiN.2006.Toxicpotentialof materials at the nanolevel［J］.Science,311（5761）:622-627

Smart S K,Cassady A I,Lu G Q,Martin D J.2006.The biocompatibility of carbon nanotubes［J］.Carbon,44（6）:1034-1047

Teeguarden J G,Hinderliter P M,Orr G,Thrall B D,Pounds J G.2007.Particokinetics in vitro:Dosimetry considerations for in vitro nanopar-ticle toxicity assessments［J］.Toxicological Sciences,95（2）:300-312

Wang J X,Li W,Liu Y,Lao F,Chen C Y,Fan Y B.2008.Environmentalhealthandecotoxicologicaleffectoftitanium dioxide nanomaterials［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,3（2）:105-113（in Chinese）

Warheit D B,Laurence B R,Reed K L,Roach D H,Reynolds G A,Webb T R.2004.Comparative pulmonary toxicity assessment of single-wall carbon nanotubesin rats［J］.Toxicological Sciences,77（1）:117-125

Xie Y,Li Z Y,Feng L,Wang Q X,Cao H.2008.Detection methodanditsapplicationfortoxicantusingalgae［J］.Environmental Science&Technology,31（12）:77-83（in Chinese）

Yu X W,Zhao Z K,Han B,Hu C L,Yang X,Yuan J L.2009.Preliminarystudyonthetoxicityofnanosizedsilicon dioxideonembryonicdevelopmentofzebrafishembryos［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,4（5）:675-681（in Chinese）

Zhao M M,Wang H L,Wang J W,Cui M M,Yuan J L,Ding S M,Yang X.2008.Study on liver protein oxidative damage induced by single-walled carbon nanotubes in mice［J］.Journal of Public Health and Preventive Medicine,19（4）:4-5（in Chinese）

Zhu R R,Wang S L,Chen X P,Sun X Y,Zhang R,Yao S D.2006.Selective apoptosis inducing effect of nano-TiO2on CHO cells［J］.Acta Chimica Sinica,64（21）:2161-2164（in Chinese）

Zhu R R,Wang S L,Yao S D.2005.The biotoxic study about ultrafine titanium dioxide［J］.Chemistry of Life,25（4）:344-346（in Chinese）

Zhu X S,Zhu L,Tian S Y,Lang Y P,Li Y.2008.Toxicity effectofthreekindsofcarbonnanomaterialsonaquatic organisms［J］.China Environmental Science,28（3）:269-273（in Chinese）

Zou L.2004.The single-wall carbon nanotube and its application［J］.Journal of Kunming Metallurgy College,20（1）:21-23（in Chinese）

中文參考文獻

馮晶,肖冰,陳敬超.2006.納米材料對生物體及環(huán)境的影響［J］.材料科學與工程學報,24（3）:462-465

周永欣,章宗涉.1989.水生生物毒性試驗方法［M］.北京:農業(yè)出版社,175-176

孟幻,陳真,趙宇亮.2006.部分納米材料的納米生物學效應研究［J］.基礎醫(yī)學與臨床,26（7）:699-703

朱小山,朱琳,田勝艷,郎宇鵬,李燕.2008.三種碳納米材料對水生生物的毒性效應［J］.中國環(huán)境科學,28（3）:269-273

朱融融,汪世龍,姚思德.2005.納米二氧化鈦的生物學效應［J］.生命的化學,25（4）:344-346

朱融融,汪世龍,陳小平,孫曉宇,張蕤,姚思德.2006.納米二氧化鈦對卵巢腫瘤細胞的選擇性凋亡的誘導作用［J］.化學學報,64（21）:2161-2164

林治卿,襲著革,晁福寰,楊丹鳳,張華山.2006.單壁納米碳管對大鼠主動脈內皮細胞損傷作用的研究［J］.生態(tài)毒理學報,1（4）:362-369

汪冰,豐偉悅,趙宇亮,邢更妹,柴之芳,王海芳,賈光.2005.納米材料生物效應及其毒理學研究進展［J］.中國科學B輯:化學,35（1）:1-10

王江雪,李煒,劉穎,勞芳,陳春英,樊瑜波.2008.二氧化鈦納米材料的環(huán)境健康和生態(tài)毒理效應［J］.生態(tài)毒理學報,3（2）:105-113

白春禮.2001.納米科技及其發(fā)展前景［J］.科學通報,46（2）:89-92

諸穎,李文新.2008.碳納米管的細胞毒性［J］.中國科學B輯:化學,38（8）:677-684

謝艷,李宗蕓,馮琳,王秋香,曹慧.2008.藻類毒物檢測方法及其應用研究進展［J］.環(huán)境科學與技術,31（12）:77-83

玉曉微,趙占克,韓冰,胡傳祿,楊旭,袁均林.2009.納米二氧化硅對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究［J］.生態(tài)毒理學報,4（5）:675-681

趙明明,王紅蕾,王江偉,崔萌萌,袁均林,丁書茂,楊旭.2008.單壁碳納米管致小鼠肝臟組織蛋白質氧化損傷的研究［J］.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學,19（4）:4-5

鄒莉.2004.單壁碳納米管及應用現(xiàn)狀［J］.昆明冶金高等?？茖W校學報,20（1）:21-23◆

Effects of Nano-TiO2and Single-Walled Carbon Nanotubes on the Growth of Chlorella vulgaris

YANG Xiao-jing2，CHEN Hao1，YAN Hai2，*，QIN Bo2

1.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
2.Department of Biological Science and Technology,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083

Nanomaterials have been widely used in many fields because of its unique physical and chemical properties.The safety of nanomaterials on organisms is paid increasing attention by people.In this paper,a standard method of algal bioassay for evaluating the toxicity of toxic chemicals was used and the inhibitory effects of nano-TiO2and single-walled carbon nanotubes（SWCNTs）on the growth of Chlorella vulgaris were investigated,respectively.Results showed that the growth of Chlorella vulgaris could not be apparently affected by initial nano-TiO2concentrations from 0.01mg·L-1to 500mg·L-1.However SWCNTs could inhibit the growth of Chlorella vulgaris significantly and its 96h-EC50was calculated as 261.5mg·L-1based on the experimental data.Compared with nano-TiO2,SWCNTs agglomerated and adsorbed a greater amount of the cells of Chlorella vulgaris,which may be responsible for its higher inhibitory effect on the growth of Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris；nano-TiO2；single-walled carbon nanotubes；toxicity

29 April 2009accepted24 May 2009

1673-5897（2010）1-038-06

X171.5

A

2009-04-29錄用日期：2009-05-24

國家自然科學重點基金（No.20537020）；北京科技大學冶金工程研究院基礎理論研究基金；北京科技大學多學科交叉項目

楊曉靜（1983—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:haiyan@sas.ustb.edu.cn

閆海（1962—），男，博士，教授，博士生導師，北京科技大學應用科學學院生物技術系主任，主要研究方向為微細藻類和微生物的環(huán)境生物技術.