劉勇，張高生，陳琳琳，任宗明，*，付榮恕，王子健，趙建平，高占國，翁燕波

1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺264003

2.山東師范大學生命科學學院，濟南250014

3.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085

4.寧波市環(huán)境監(jiān)測中心，寧波315012

2種除草劑聯(lián)合脅迫下日本青鳉的逐級行為響應(yīng)

劉勇1，2，張高生1，陳琳琳1，任宗明1，*，付榮恕2，王子健3，趙建平4，高占國4，翁燕波4

1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，煙臺264003

2.山東師范大學生命科學學院，濟南250014

3.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085

4.寧波市環(huán)境監(jiān)測中心，寧波315012

探討了日本青鳉在兩種除草劑阿特拉津和百草枯聯(lián)合暴露下的逐級行為響應(yīng)，采用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)（BEWs）記錄行為強度數(shù)據(jù)，分析不同暴露濃度、不同暴露時間日本青鳉的行為響應(yīng).10、5、1和0.1TU的暴露濃度下行為反應(yīng)時間分別為：0.74、7.7、29.4和42.2h，而每個濃度不同配比之間行為反應(yīng)時間差異明顯.結(jié)果表明：在兩種除草劑的暴露下，日本青鳉的逐級行為響應(yīng)既受化合物濃度高低的影響，又受暴露時間的影響，而且每個濃度兩種藥物不同配比暴露下的青鳉魚的逐級行為響應(yīng)基本一致，每個濃度不同配比之間行為反應(yīng)時間差異明顯，即兩種作用機制不同的除草劑對日本青鳉的行為毒性是協(xié)同作用.

除草劑；聯(lián)合作用；日本青鳉；逐級行為響應(yīng)

1 引言（Introduction）

阿特拉津是一種在世界范圍內(nèi)廣泛使用的中等偏低毒性除草劑，已有50余年歷史.阿特拉津使用量大、殘留期長，農(nóng)田施用后在水中能抵抗自然的遞降分解作用，因此近年來不斷有阿特拉津污染事件的報道.阿特拉津的長期、大量施用已經(jīng)對水生態(tài)系統(tǒng)和飲用水源構(gòu)成嚴重威脅（Hayes et al.,2002）.百草枯自1962年作為除草劑上市后，現(xiàn)已在130多個國家廣泛使用.百草枯中毒死亡率高達50%～80%，其毒性作用目前已引起廣泛重視.百草枯對人毒性極大，且無特效藥，口服中毒死亡率可達90%以上（Chen et al.,2000）.在實際生產(chǎn)過程中，阿特拉津和百草枯通常交替使用，因此實際環(huán)境中存在兩種除草劑的聯(lián)合作用.

日本青鳉（Oryzias latipes）隸屬鳉科，個體小，全長2.5～5.0cm，可以耐受低溶氧和較寬的水溫和鹽度范圍.由于其生物學背景研究非常充分，自從Denny等（1987）對青鳉飼養(yǎng)管理與實驗操作進行了規(guī)范化后，青鳉作為模式實驗動物已被多數(shù)世界組織認可（Yamamoto et al.,1975;任宗明和李志良，2009），并于20世紀80年代被國際標準化組織列為毒性實驗受試種之一.目前，日本青鳉的行為變化已經(jīng)作為一個重要指標已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到水質(zhì)監(jiān)測中（Shioda et al.,2000;任宗明等，2008）.

本研究利用日本青鳉行為變化分析了阿特拉津和百草枯聯(lián)合作用下的環(huán)境脅迫導(dǎo)致的生物逐級行為響應(yīng)，以期結(jié)合不同化合物的聯(lián)合作用研究，分析在實際污染環(huán)境下受試生物的行為響應(yīng)機制，發(fā)展一定環(huán)境脅迫下生物行為逐級脅迫模型.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 監(jiān)測系統(tǒng)

在日本青鳉行為在線監(jiān)測中，采用水質(zhì)安全在線生物預(yù)警系統(tǒng)（BEWs，中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心研制）進行（任宗明等，2007;2008）.

不同的生物個體大小采用相匹配的傳感器：日本青鳉行為監(jiān)測過程中，采用直徑5cm、長7cm的圓柱形生物傳感器.

2.2 生物培養(yǎng)

日本青鳉由本實驗室飼養(yǎng)并繁殖馴化多代，已獲得相對純正的實驗魚體系.采用流水繁殖，繁殖水溫為（25±2）℃，光照周期16L:8D.剛孵出2d內(nèi)，無需投喂餌料.2d后使用剛孵出豐年蟲作為開口餌料，每天2～3次飽食投喂.15d后即使用配合飼料投喂，每天投喂2次.保持密度為每升水2～3條（Teather et al.,2001）.

2.3 實驗設(shè)計

本實驗采用流水環(huán)境監(jiān)測日本青鳉逐級行為反應(yīng).在化合物暴露實驗過程中，選取目前比較常用的除草劑：百草枯、阿特拉津.其標準樣品從中國標準樣品中心購買.將化合物對日本青鳉的48h半數(shù)致死劑量（50%Lethal Concentration of 48h），LC50～48作為1個毒性單位（Toxic Unit,TU）（Ren et al.,2009a;2009b），每種農(nóng)藥組合設(shè)定4個濃度組，分別為0.1、1、5和10 TU.每個相同濃度組的2種農(nóng)藥按照下列比例混合（cP:cA）：10:0；7:3；5:5；3:7；0:10，進行2種除草劑的聯(lián)合作用對日本青鳉逐級行為響應(yīng)研究.每種比例的化合物聯(lián)合作用進行3組平行，結(jié)果以3組平行結(jié)果的平均值顯示.

實驗過程中，為了明確生物綜合行為的變化，采用生物綜合行為強度（Behavior strength）來反映其行為變化（Ren et al.,2009a;2009b），在此過程中，判斷日本青鳉行為發(fā)生劇烈變化的標準是：變化前連續(xù)5次行為強度平均值與變化后連續(xù)5次行為強度平均值的相對差值降低達到20%以上（Ren et al.,2009a;2009b），而低濃度（1TU和0.1TU）則需要10%的行為強度降低為顯著變化.

在日本青鳉流水實驗過程中，每通道保持3條2.5～3.0cm體長的健康日本青鳉，直至實驗結(jié)束.實驗過程中不投加食物，并控制每個通道水體流速每小時2L（Guilhermino et al.,2000）.

試驗用水為充分曝氣的自來水，溫度（25±2）℃，溶解氧>8mg·L-1，硬度以CaCO3計，（250±25）mg·L-1，控制光照周期16h:8h（白天:黑夜，白天04:00～20:00，夜間21:00～04:00），為保證生物行為監(jiān)測平行，每次行為監(jiān)測實驗開始于第1d 16:00，第3d 16:00結(jié)束.空白采用國際標準化組織規(guī)定的標準水（Standard reference water,SRW）（Cladocera et al.,1996），pH值為7.8±0.2，硬度以CaCO3計為（250±25）mg·L-1.

3 結(jié)果（Results）

3.1 行為強度與化合物濃度之間關(guān)系

結(jié)合研究報道，2種除草劑對日本青鳉LC50～48分別為阿特拉津10mg·L-1和百草枯7.2mg·L-1（NishiuchiandHashimoto,1967;Hashimotoand Nishiuchi,1981）.本研究中，以上述化合物的LC50～48作為日本青鳉的1個毒性單位（1TU），并以SRW為對照，研究一定化合物暴露下的日本青鳉的綜合行為強度變化.

圖1 不同濃度阿特拉津和百草枯聯(lián)合作用下日本青鳉48h行為強度變化

不同濃度阿特拉津和百草枯聯(lián)合作用下日本青鳉48h的行為強度變化如圖1所示.圖1表示的行為強度變化結(jié)果中，對照組內(nèi)日本青鳉行為強度基本維持在0.7左右，但其最大值位于0.8左右，最小值位于0.5左右，尤其在暴露時間8h左右（Ⅰ，黑暗）和32h左右（Ⅱ，黑暗），日本青鳉行為強度比20h左右（Ⅲ，光照）和40h左右（Ⅳ，光照）明顯降低（圖1-（a））.產(chǎn)生對照組行為強度變化的原因可能在于日本青鳉行為變化的內(nèi)在節(jié)律，即生物鐘現(xiàn)象（Biological clock）（Binkley et al.,1978;Wang et al.,2006;任宗明等，2009）.因此，在不同濃度阿特拉津和百草枯聯(lián)合作用下日本青鳉的行為強度變化結(jié)果分析中，應(yīng)該考慮到生物鐘現(xiàn)象對日本青鳉行為變化的影響.

在暴露組中，不管cP:cA的比例為多少，隨著暴露濃度的逐漸升高，日本青鳉行為強度均會明顯降低.在較高濃度（5和10TU）暴露中，日本青鳉行為強度變化在經(jīng)歷一個逐漸降低過程以后，逐漸趨于零.而在此過程中，日本青鳉的行為強度基本上是逐漸降低的，沒有明顯的行為調(diào)解（行為強度回復(fù)）過程，這與日本青鳉在有機磷農(nóng)藥暴露中的行為強度變化是不同的.上述行為變化的差異性主要歸因于不同污染物的毒性效應(yīng)作用機制不同，這可能是日本青鳉行為強度逐漸降低而沒有出現(xiàn)行為調(diào)解的主要原因（John et al.，2009）.阿特拉津會使魚體內(nèi)的Ca2+、Mg2+等無機離子濃度顯著下降，從而導(dǎo)致其重要的生理功能發(fā)生紊亂（Prasad and Reddy,1994），百草枯主要是通過其強氧化作用，使機體內(nèi)還原酶及脂質(zhì)的氧化,或直接或間接損傷DNA，使細胞壞死或凋亡（Suntres et al.,2002）.在較低濃度（1和0.1TU）暴露中，日本青鳉行為變化主要以調(diào)整為主，并且其調(diào)整過程基本符合對照組內(nèi)日本青鳉的行為過程，具有明顯內(nèi)在節(jié)律性.但是，該濃度組中日本青鳉的行為強度在暴露后期出現(xiàn)明顯的降低，該現(xiàn)象與對照組相比較，行為強度差異明顯.這2個濃度組出現(xiàn)行為調(diào)解過程的原因可能是低濃度的環(huán)境污染物導(dǎo)致細胞和器官損傷，但并未超過受試生物啟動行為調(diào)節(jié)機制的閾值，受試生物通過行為調(diào)解對抗環(huán)境脅迫對自己的損傷.

化合物濃度增高，日本青鳉行為變化劇烈，隨暴露化合物濃度降低，日本青鳉行為過程增加，發(fā)生的調(diào)解行為增多.暴露結(jié)束，日本青鳉行為強度也從高濃度的零值升高到0.4左右.上述分析表明，日本青鳉行為強度變化與暴露化合物濃度密切相關(guān)，在暴露時間確定情況下，日本青鳉行為強度變化直接受環(huán)境內(nèi)化合物濃度的影響.

3.2 行為強度與暴露時間之間關(guān)系

根據(jù)實驗設(shè)計中判斷日本青鳉行為發(fā)生劇烈變化的標準，日本青鳉在不同濃度配比的化合物暴露下的行為強度明顯變化所需時間見表1.

表1 日本青鳉在不同濃度配比的阿特拉津和百草枯暴露下的行為強度明顯變化所需時間Table 1The evident difference of the behavioral response time of medaka under different proportion of the two herbicides

不同濃度的暴露中，在日本青鳉發(fā)生行為強度明顯變化以后，行為過程會產(chǎn)生明顯不同.在較高濃度中，日本青鳉行為強度會逐漸降低至消失，而在較低濃度中，日本青鳉行為強度變化經(jīng)歷明顯降低后，會產(chǎn)生明顯的行為調(diào)節(jié)過程，尤其是在1TU和0.1TU暴露中，該過程與幾乎發(fā)生在暴露20h左右，與對照組的行為生物鐘現(xiàn)象相對應(yīng).

試驗結(jié)果顯示，兩種除草劑隨其濃度的增加，行為強度明顯變化時間呈明顯下降趨勢（圖2），它們的聯(lián)合作用劑量與其毒性效應(yīng)具有明顯的正相關(guān)，其毒性效應(yīng)趨勢與單一污染物效應(yīng)是不同的，聯(lián)合毒性作用下行為變化時間明顯小于單一污染物作用下行為反應(yīng)時間.結(jié)果表明，暴露濃度越低，日本青鳉行為強度發(fā)生明顯變化所需時間越長，并且，從總體變化趨勢分析，該改變化時間長短與cP:cA存在直接聯(lián)系（圖2）.

由此得出進一步結(jié)論：作為作用機制不同的的2種除草劑百草枯和阿特拉津?qū)θ毡厩圜毜男袨槎拘詰?yīng)該是協(xié)同作用（Eldefrawi et al.,1985;李志良等，2007）.

4 討論（Discussion）

從日本青鳉行為強度變化與化合物濃度和暴露時間關(guān)系分析，在一定濃度的除草劑暴露中，其行為強度變化與暴露時間直接關(guān)聯(lián)，而在暴露時間確定的情況下，行為強度變化與暴露濃度相關(guān).同時，日本青鳉暴露于一定污染環(huán)境以后，其行為變化主要經(jīng)歷行為刺激、行為適應(yīng)、行為調(diào)整甚至再調(diào)整，直至產(chǎn)生明顯行為毒性效應(yīng)（Ren et al.，2007）.在上述行為調(diào)節(jié)過程中，環(huán)境脅迫閾對生物行為變化起決定性作用.

一定濃度污染物暴露下日本青鳉行為變化與暴露時間之間的關(guān)系，在不考慮生物行為內(nèi)在節(jié)律性前提下，符合基于大型蚤行為變化構(gòu)建逐級行為模型（圖3）（任宗明等，2005）.

在低濃度除草劑暴露濃度下，行為強度隨暴露時間延長呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，并且在暴露時間確定的情況下，日本青鳉行為強度變化與暴露化合物濃度直接相關(guān)，同時，在大部分暴露過程中，日本青鳉行為強度會經(jīng)歷明顯的行為適應(yīng)和調(diào)節(jié)過程，因此，日本青鳉逐級行為響應(yīng)既受化合物濃度大小影響，又與暴露時間密切相關(guān)，結(jié)合上述分析，其行為強度變化主要經(jīng)歷行為刺激、行為適應(yīng)、行為調(diào)整甚至再調(diào)整，直至產(chǎn)生明顯行為毒性效應(yīng)，行為趨勢符合如圖3所示的逐級行為模型.

結(jié)合行為強度與化合物濃度和暴露時間之間關(guān)系分析，在逐級行為模型中，日本青鳉無效應(yīng)行為變化和行為刺激組成的行為強度變化過程（回避行為過程）和所維持的時間長短主要受暴露化合物濃度影響，并呈現(xiàn)明顯規(guī)律性，并由此決定環(huán)境脅迫導(dǎo)致第一行為脅迫閾發(fā)揮作用的時間和強度.環(huán)境脅迫越大，回避行為過程越短，第一行為脅迫閾對日本青鳉產(chǎn)生的脅迫越強，在行為適應(yīng)失敗以后，可能直接導(dǎo)致日本青鳉的毒性效應(yīng).在較強的環(huán)境脅迫下，日本青鳉可能會在經(jīng)歷行為適應(yīng)和調(diào)整過程后，遭受第二行為脅迫閾的直接影響.由此，日本青鳉在一定環(huán)境脅迫下，會產(chǎn)生明顯的逐級行為調(diào)整過程，直至其行為毒性效應(yīng)產(chǎn)生.日本青鳉逐級行為調(diào)整，尤其是在回避行為產(chǎn)生以后，既受環(huán)境化合物濃度影響，又與暴露時間相關(guān).

研究結(jié)果證明，在百草枯和阿特拉津兩種除草劑聯(lián)合暴露下，日本青鳉的逐級行為響應(yīng)既受化合物濃度大小的影響，又受暴露時間的影響，而且每個濃度的不同配比之間的行為反應(yīng)時間差異明顯，即每個濃度兩種藥物不同配比暴露下的青鳉魚的逐級行為響應(yīng)是不一致的.實驗結(jié)果證明了兩種作用機制不同的除草劑對日本青鳉的行為毒性不是簡單的相加作用，而是協(xié)同作用，同時表明日本青鳉逐級行為響應(yīng)既受化合物濃度大小影響，又與暴露時間密切相關(guān).

針對日本青鳉在產(chǎn)生行為過程中的明顯生物鐘現(xiàn)象，為了進一步明確行為調(diào)解與行為內(nèi)在節(jié)律之間關(guān)系，在后續(xù)水生生物行為強度變化研究中，有必要考慮生物鐘現(xiàn)象對生物行為調(diào)節(jié)的影響.

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The Stepwise Behavioral Responses of the Japanese Medaka under the Joint Stress of Two Herbicides

LIU Yong1，2，ZHANG Gao-sheng1，CHEN Lin-lin1，REN Zong-ming1，*，F(xiàn)U Rong-shu2，WANG Zi-jian3，ZHAO Jian-ping4，GAO Zhan-guo4，WENG Yan-bo4

1.Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai 264000
2.College of Life Science,Shandong Normal University,Ji’nan 250014
3.Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
4.Ningbo Environmental Monitoring Center,Ningbo 315012

In this study,the stepwise behavioral responses of the Japanese medaka（Oryzias latipes）under the joint stress of two herbicides（Atrazine and Paraquat）were discussed.BEWs was used to record the data of behavior strength to analyze the behavioral responses of Japanese medaka.The evident difference of the behavioral responses time were:0.74、7.7、29.4 and 42.2h,and evident difference of the behavioral responses time was detected.The results suggested that the stepwise behavioral responses of the Japanese medaka were affected by both the chemical concentration and exposure time.And the evident difference of the behavioral response time was detected.The stepwise behavioral responses in different proportion of the two herbicides were almost the same as each other.It proved that the toxicity effects of the joint stress of the two herbicides on the stepwise behavioral responses of Japanese medaka were synergistic.

herbicide；combined toxicity；Japanese Medaka（Oryzias latipes）；stepwise behavioral responses

2 December 2009accepted15 January 2010

1673-5897（2010）1-032-06

X171.5

A

2009-12-02錄用日期：2010-01-15

國家水體污染控制與治理科技重大專項（No.2009ZX07527-002-06）；環(huán)保公益性行業(yè)科研專項（No.200809147）

劉勇（1983—），男，碩士研究生，E-mail:biolyqh@yahoo.com.cn；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:zmren@yic.ac.cn

任宗明（1978—），副研究員，主要從事生態(tài)毒理學方面的研究.