高立紅, 史亞利, 厲文輝, 劉杰民, 蔡亞岐＊

(1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100085;2.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京100083)

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測環(huán)境水樣中22種抗生素類藥物

高立紅1,2, 史亞利1, 厲文輝1, 劉杰民2, 蔡亞岐1＊

(1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100085;2.北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京100083)

建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESIMS/MS)分析環(huán)境水樣中22種抗生素類藥物的方法。采用HLB固相萃取柱對環(huán)境水樣中的目標(biāo)化合物進(jìn)行富集、凈化,然后以6mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)溶液洗脫。收集的洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈芍?mL,然后進(jìn)行HPLC-ESIMS/MS分離分析。色譜流動相A相為甲醇-乙腈(1∶1,v/v),B相為0.3%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸銨,pH2.9);色譜柱為XTerra MS C18柱。質(zhì)譜檢測采用正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測模式。分別以自來水和污水作為基質(zhì),22種抗生素類藥物的加標(biāo)平均回收率分別為54.9%～130%和57.4%～138%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)分別為2.85%～28.6%和2.02%～23.2%;方法的檢出限為0.05～0.5ng/L。將建立的方法應(yīng)用于北京市高碑店湖和小清河水樣的分析,結(jié)果表明在兩個水樣中均有部分抗生素類藥物檢出。

高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法;固相萃取;抗生素類藥物;環(huán)境水樣

Abstract:A method for the determination of22antibiotics in Environmental water samples was developed by using high perform anceliquid Chromatography-electrosp ray ionizationtandem mass spectrometry(HPLC-ESIMS/MS).The target antibiotics in water samples were enriched and cleaned-up by HLB solid-phase extraction(SPE)cartridges,and then eluted with6mL ammonium hydroxide-m ethanol(5∶95,V/V).The eluate was collected and concentrated to1 mL under a gentle stream of nitrogen gas,and then analyzed by HPLC-ESIMS/MS in positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring(MRM)m ode.The separation was carried out on an XTerra MS C18column with mobile phases of A,m ethanol-acetonitrile(1∶1,v/v),and B,0.3%formic acid/water(containing0.1%ammonium form ate,V/V,pH2.9).The results show ed that the average recoveries of antibiotics in tap water and wastewater were54.9%-130%and57.4%-138%,respectively,and the corresponding relative standard deviations(RSD,n=3)were2.85%-28.6%and2.02%-23.2%,respectively.The method detection limits were0.05-0.5ng/L.The developed method was app lied to analyze the water samples of Gaobeidian Lake and Xiaoqinghe River in Beijing.The results show ed that some antibioticswere detected both in the two samples.

Key words:high performance liquid Chromatography-electrosp rayionizationtande mmass spectrometry(HPLC-ESI MS/MS);solid-phase extraction(SPE);antibiotics;Environmental water samples

抗生素(antibiotics)是指由細(xì)菌、霉菌或其他微生物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類物質(zhì)。抗生素類藥物主要應(yīng)用于人和動物的疾病治療,同時也以亞治療劑量長期添加于動物飼料中,以預(yù)防疾病和促進(jìn)動物生長[1]。目前廣泛使用的抗生素類藥物有喹諾酮類(quinolones,QN s)、四環(huán)素類(tetracyclines,TCs)、磺胺類(sulfonam ides,SAs)和大環(huán)內(nèi)酯類(macrolides,MALs)等。人畜服用的抗生素類藥物大多不能被充分吸收利用而隨排泄物進(jìn)入污水或直接排入環(huán)境。雖然許多抗生素的半衰期較短,但由于其被頻繁地使用并進(jìn)入環(huán)境,導(dǎo)致其形成“假持續(xù)”現(xiàn)象[2]。這已經(jīng)成為水資源重復(fù)利用的一個巨大挑戰(zhàn),同時誘發(fā)了各類抗生素耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生,對人類健康和整個生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了長期潛在的威脅。

近年來,高效液相色譜技術(shù),包括高效液相色譜-熒光法(HPLC-FLD)[3,4]、高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[5-8]和高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[9-17]等,已經(jīng)成為抗生素類藥物殘留檢測的首選技術(shù)。Ibá ?ez等[18]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(U PLC-Q TO F MS)同時檢測了地表水和污水中的42種抗生素類藥物殘留。目前國內(nèi)對于環(huán)境水樣中多種抗生素殘留同時檢測方法的報道還較少。

本文建立了采用HPLC-MS/MS同時檢測環(huán)境水樣中3類22種抗生素類藥物的分析方法。采用固相萃取(SPE)技術(shù)對環(huán)境水樣中樣品進(jìn)行富集和凈化。該方法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),可滿足各種環(huán)境水樣中抗生素類藥物殘留檢測的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

U lt iM ate3000液相色譜儀,配有U lt iM ate3000自動進(jìn)樣器,P680二元梯度泵和Chromeleon6.70色譜工作站(美國D ionex公司);API3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司),配有電噴霧離子源(ESI)和Analyst1.4.1工作軟件;Oasis HLB SPE柱(6mL,200m g)(美國W aters公司);Votex渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);M illi-Q超純水儀(美國M illipore公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,美國Fisher公司),氨水(50%,體積分?jǐn)?shù))和甲酸銨(純度為99%,美國A lfa Aesar公司),甲酸(純度為98%,美國Fluka公司),乙二胺四乙酸二鈉鹽(N a2ED TA)(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。喹諾酮類抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)品:氧氟沙星(ofloxacin,O FL,純度為99.9%)、諾氟沙星(norfloxacin,NOR,純度為99.9%)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,C IP,純度為99.9%)、沙拉沙星(sarafloxacinhydrochloride,SAR,純度為95.0%)、氟羅沙星(fleroxacin,FLE,純度為99.5%)、洛美沙星(lom efloxacin hydrochloride,LOM,純度>98%)、雙氟沙星(difloxacin hydrochloride,D IF,純度為98.0%)、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR,純度為99.9%)(均購于美國Sigm a-A ldrich公司);大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)品:紅霉素(erythromycin A-dihydrate,ERY,純度為99.1%)、羅紅霉素(roxithrom ycin,ROX,純度≥90%)、交沙霉素(josam ycin,JOS,純度≥98%)、酒石酸泰樂菌素(tylosintartrate,TYL,純度為82.4%)、螺旋霉素(sp iram ycin,SPI,純度為88.9%)(均購于美國Sigm a-A ldrich公司);磺胺類抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD Z,純度為99.7%)、磺胺甲基嘧啶(sulfam erazin,SMR,純度為99.9%)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadim ethoxin,SDM,純度為99.4%)、磺胺二甲基異惡唑(sulfisoxazole,SIA,純度≥99.0%)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfam onom ethoxine,SMM,純度>98%)(均購于美國Sigm a-A ldrich公司),磺胺噻唑(sulfathiazole,ST,純度>98%)、磺胺吡啶(sulfapyridine,SPD,純度>98%)、磺胺甲基異惡唑(sulfa methoxazole,SMX,純度>98%)(均購于日本東京化成工業(yè)株式會社),磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SDMD,純度為99%)(購于美國Acros O rganics公司);替代物標(biāo)準(zhǔn)品:諾氟沙星-d5(norfloxacin-d5,NOR-d5,純度為99%)(美國Sigm a-A ldrich公司),磺胺甲基異惡唑-d4(sulfam ethoxazole-d4,SMX-d4)、磺胺二甲基嘧啶-d4(sulfam ethazine-d4,SDMD-d4)、紅霉素-13C,d3(erythrom ycin-13C,d3,ERY-13C,d3)(購于加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:分別稱取10.0m g標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶中,配制成400m g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20℃下保存。取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量,用甲醇配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,密封,于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

XTerra MS C18型色譜柱(2.1mm×100mm,3.5μm,美國W aters公司);流動相A:甲醇-乙腈(1∶1,v/v),流動相B:0.3%甲酸水溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸銨,pH2.9);流速:0.2mL/m in;梯度洗脫條件:0～2m in,10%A;2～12m in,10%A～70%A;12～16m in,70%A～100%A,保持3 m in;19～19.1m in,100%A～10%A;19.1～33 m in,10%A。進(jìn)樣量:15μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI),分析物在正離子掃描下以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分析。采用針泵進(jìn)樣,分別進(jìn)行Q1和Q3掃描確定離子對,進(jìn)而優(yōu)化去簇電壓(D P)等參數(shù)(見表1)。在選定的色譜條件下,接入流動相對離子源Gas1、Gas2和離子噴霧電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使信號穩(wěn)定、靈敏度最高。優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件:氣簾氣壓力為0.14M Pa,碰撞氣壓力為0.02M Pa,離子噴霧電壓為5 000V,溫度為600℃,Gas1∶0.38M Pa;Gas2∶0.45M Pa。

表1 測定22種抗生素類藥物和4種替代物的質(zhì)譜條件Table1 Experimental conditions of electrosprayionization tandem mass spectrometry for the determination of22an tibiotics and 4 surrogates

表1 (續(xù))Table1 (Con tinued)

1.3 樣品前處理方法

環(huán)境水樣經(jīng)0.45μm濾膜過濾后,準(zhǔn)確量取200mL,依次加入0.2g N a2ED TA,5ng NOR-d5,SDMD-d4,SMX-d4和20ng ERY-13C,d3,搖勻,然后用Oasis HLB SPE小柱(6mL,200m g)進(jìn)行富集凈化。上樣前,HLB小柱依次用5mL甲醇和5 mL水進(jìn)行活化;上樣時,流速控制在1mL/m in左右;上樣后,先用12mL水清洗HLB小柱,然后在負(fù)壓下抽干,最后用6mL氨水-甲醇(5∶95,v/v)洗脫。洗脫液在35℃下用氮?dú)獯蹈蓾饪s至1mL以下,最后用初始比例流動相定容至1mL,待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE條件優(yōu)化

2.1.1 SPE柱的選擇

Oasis HLB固相萃取柱填充的是親水親脂平衡、水可浸潤的反相吸附劑,是一種可適用于酸性、中性及堿性化合物的通用型萃取柱;Oasis WAX萃取柱填充的是混合型弱陰離子反相吸附劑,對強(qiáng)酸性化合物具有高的選擇性。根據(jù)目標(biāo)化合物的化學(xué)性質(zhì),考察了Oasis HLB柱和Oasis WAX柱的萃取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HLB柱對目標(biāo)化合物萃取效率較高,且該柱在干涸情況下不影響被測組分的回收率。因此,本文采用Oasis HLB固相萃取柱對樣品進(jìn)行富集和凈化。

2.1.2 洗脫液的選擇

分別采用甲醇和氨水-甲醇(5∶95,v/v)溶液為洗脫液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用氨水-甲醇溶液洗脫時,3類抗生素的回收率都在80%以上;采用甲醇洗脫時,盡管SAs類和MALs類抗生素的回收率在80%以上,但QN s類抗生素的回收率較低,為65%～80%。因此本文采用氨水-甲醇溶液進(jìn)行洗脫。另外,分別考察了不同洗脫液用量(4,6,8和10mL)對抗生素回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)洗脫液用量大于或等于6mL時,22種抗生素可被完全洗脫,因此洗脫液用量確定為6mL。

2.1.3 水樣pH值的選擇

用甲酸和氨水將水樣(去離子水)調(diào)至不同的pH值(pH2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0),考察其對抗生素回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)pH為4.0～8.0時,目標(biāo)化合物的回收率較高。由于天然水樣的pH值一般在pH4.0～8.0之間,因此本文不對實(shí)際水樣的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié),這與文獻(xiàn)[11]中所報道的一致。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動相的pH值對抗生素的分離和保留具有重要的影響。在低pH條件下,22種抗生素都可實(shí)現(xiàn)良好分離。本文采用0.3%甲酸水溶液(含0.1%甲酸銨)緩沖體系來控制流動相B的pH值(pH 2.9),且甲酸有利于目標(biāo)化合物的離子化,可得到較高的檢測靈敏度。

分別考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1,v/v)體系作為流動相A對22種抗生素色譜行為的影響。結(jié)果表明,3種流動相體系都能得到尖銳對稱的峰形,但甲醇-乙腈(1∶1,v/v)體系作為流動相時,質(zhì)譜的響應(yīng)值更高。因此本文采用甲醇-乙腈(1∶1,v/v)和0.3%甲酸水溶液(含0.1%甲酸銨)作為流動相,在流速為0.2mL/m in條件下,考察并最終確定了1.2.1節(jié)的梯度淋洗程序。如圖1所示,其中圖1a為22種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離圖,圖1b～d分別為喹諾酮類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離圖。

圖1 (a)22種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、(b)8種喹諾酮類抗生素、(c)9種磺胺類抗生素和(d)5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of(a)a mixture solution of 22antibiotic standards,(b)8standard quinolones,(c)9standard sulfonamides and(d)5standard macrolides

2.3 線性范圍和檢出限

在選定的色譜和質(zhì)譜條件下,對一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(替代物NOR-d5、SDMD-d4、SMX-d4的質(zhì)量濃度固定為5μg/L,ERY-13C,d3固定為20μg/L)進(jìn)行分析。以各分析物和替代物定量離子對的峰面積之比進(jìn)行定量,得到的各分析物檢測的線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)等參數(shù)見表2所示。結(jié)果表明,22種化合物均在較寬的范圍內(nèi)具有良好的線性,儀器的檢出限(LOD)(信噪比為3)為0.01～0.1μg/L,因此方法對實(shí)際環(huán)境水樣的檢出限可以達(dá)到0.05～0.5ng/L。

表2 22種抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)及檢出限(LOD s,S/N=3)Table2 Regression equations,correlation coefficients(r2)and limits of detection(LOD s,S/N=3)of22an tibiotics

2.4 方法的精密度與準(zhǔn)確度

分別在自來水和污水樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),加標(biāo)水平為25ng/L和500ng/L,按1.3節(jié)所述方法對樣品進(jìn)行處理,平行測定3份,考察方法的回收率和重現(xiàn)性。NOR-d5、SMX-d4、SDMD-d4和ERY-13C,d3作為替代物在富集之前與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液一起加入到水樣中。分析結(jié)果列于表3。從表3中可以看出:本文采用的前處理方法對22種抗生素具有良好的精密度與準(zhǔn)確度。自來水中的加標(biāo)回收率為54.9%～130%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.85%～28.6%;污水中的加標(biāo)回收率為57.4%～138%,RSD為2.02%～23.2%。

表3 自來水和污水樣品中22種抗生素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=3)Table3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD s)of22antibiotics in tap water and waste water samples(n=3)

2.5 實(shí)際水樣分析

采集北京市朝陽區(qū)高碑店湖和海淀區(qū)小清河表層水,采樣時間為2009年12月11日。采用優(yōu)化的SPE條件和HPLC-MS/MS分析條件,分別對高碑店湖水樣(1#)和小清河水樣(2#)進(jìn)行分析,結(jié)果列于表4。研究結(jié)果表明,兩個水樣中均檢出部分抗生素類藥物,其中O FL、SD Z、SPD、SMX、ERY和ROX含量較高,最高為2#樣品中SD Z的含量為715 ng/L。高碑店湖和小清河分別為高碑店污水處理廠和清河污水處理廠的受納河體,這說明抗生素在污水處理過程中未被完全去除,從而進(jìn)入水環(huán)境中。它們的遷移轉(zhuǎn)化和生態(tài)效應(yīng)值得進(jìn)一步研究。

表4 環(huán)境水樣中抗生素的含量Table4 Concentrations of22antibiotics in the environmental water samplesn g/L

3 結(jié)語

本文采用SPE與HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)建立了環(huán)境水樣中22種抗生素類藥物殘留的分析方法。該方法具有較高的靈敏度和選擇性。將其應(yīng)用于北京市高碑店湖和小清河水樣中抗生素類藥物殘留分析,兩個水樣中均可檢出抗生素類藥物殘留,其中以磺胺嘧啶含量最高。

[1] Wang R,Liu T Z,Wang T.Acta Ecologica Sinica(王冉,劉鐵錚,王恬.生態(tài)學(xué)報),2006,26(1):265

[2] Zhou Q X,Luo Y,WangM E.Asian Journal of Ecotoxicology(周啟星,羅義,王美娥.生態(tài)毒理學(xué)報),2007,2(3):243

[3] Nakata H,Kannan K,Jones P D,et al.Chem osphere,2005,58:759

[4] Liu J J,Lin L M,J iang Z G,et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(劉靖靖,林黎明,江志剛,等.分析試驗(yàn)室),2007,26(8):5

[5] Chen H H,Dai J,Wang H X,et al.Journal of Instrumental Analysis(陳輝華,戴軍,王洪新,等.分析測試學(xué)報),2008,27(9):951

[6] García-Mayor M A,Garcinu?o R M,Fernández-Hernando P,et al.J Chromatogr A,2006,1122:76

[7] Turiel E,Martín-Esteban A,Tadeo J L.Anal Chim Acta,2006,562:30

[8] Li YW,M o C H,Zhao N,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(李彥文,莫測輝,趙娜,等.分析化學(xué)),2008,36(7):954

[9] Granelli K,Elgerud C,Lundstr?m?,et al.Anal Chim Acta,2009,637:87

[10] Carretero V,B lasco C,PicóY.J Chromatogr A,2008,1209:162

[11] M cClure E L,Wong C S.J Chromatogr A,2007,1169:53[12] Sun G D,Su Z Y,Chen M,et al.Chinese Journal of Chromatography(孫廣大,蘇仲毅,陳猛,等.色譜),2009,27(1):54

[13] Xu W H,Zhang G,Zou S C,et al.Environmental Chemistry(徐維海,張干,鄒世春,等.環(huán)境化學(xué)),2006,25(2):232

[14] Ding J,Ren N Q,Chen L G,et al.Anal Chim Acta,2009,634:215

[15] Xiao Y,Chang H,J ia A,et al.J Chromatogr A,2008,1214:100

[16] Abuin S,Codony R,Compa?óR,et al.J Chromatogr A,2006,1114:73

[17] Su Z Y,Chen M,Yuan D X,et al.Journal of Xiam en University:Natural Science(蘇仲毅,陳猛,袁東星,等.廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版),2007,46(Supp l1):72

[18] Ibá ?ez M,Guerrero C,Sancho J V,et al.J ChromatogrA,2009,1216:2529

Determination of 22 an tibiotics in environmental water samples using high performance liquid chromatography-electrosprayionization tandem mass spectrometry

GAO Lihong1,2,SHI Yali1,LI Wenhui1,LIU Jiem in2,CAI Yaqi1＊
(1.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-Environmenta l Science,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China;2.Civil and Environment Engineering School,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China)

O658

A

1000-8713(2010)05-0491-07

＊通訊聯(lián)系人:蔡亞岐,博士,研究員,主要研究方向?yàn)榄h(huán)境化學(xué).Tel:(010)62849239,E-m ail:caiyaqi@rcees.ac.cn.

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.20837003)、國家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(No.20890111)和國家“973”項(xiàng)目子課題(No.2009CB421605).

2010-01-14

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00491