焦春娜，張曉敏，趙少貞

（天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心，天津 300070）

在所有器官移植手術(shù)中，角膜移植的成功率最高。然而移植后的免疫排斥反應(yīng)仍是導(dǎo)致角膜移植失敗的主要原因[1-2]。環(huán)孢霉素A(CsA)是真菌的一種代謝物，是目前常用的免疫抑制劑。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者已充分論證了CsA在角膜移植術(shù)后降低排斥反應(yīng)的作用，并且已廣泛運(yùn)用于臨床。但在角膜移植動(dòng)物模型中，CsA肌注劑量有所不同[3-5]，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠穿透性角膜移植動(dòng)物模型，分析肌肉注射不同劑量環(huán)孢霉素A對(duì)大鼠角膜移植排斥反應(yīng)的防治作用，以期為下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中該藥的使用劑量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥品 選成年雌性清潔級(jí)Wistar大鼠 (體重200～220 g)作為供體，Lewis大鼠作為受體。大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。CsA購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。Brdu試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和手術(shù) 將33只Lewis大鼠隨機(jī)分3組，每組l1只。每只動(dòng)物僅右眼手術(shù)。進(jìn)行Wistar-Lewis鼠間同種異體角膜移植，術(shù)前用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，散瞳，于受體右眼進(jìn)行穿透性角膜移植手術(shù)，植片直徑3.5mm，植床3.0mm,l0.0尼龍線(美國(guó)Alcon)間斷縫合8～12針，術(shù)畢注入空氣形成前房。剔除伴有手術(shù)并發(fā)癥（包括白內(nèi)障、嚴(yán)重前房積膿或術(shù)后第2天前房仍不能形成）的大鼠，因這些手術(shù)并發(fā)癥會(huì)影響移植結(jié)果，且容易導(dǎo)致移植排斥的錯(cuò)誤診斷。自手術(shù)當(dāng)天開(kāi)始，每天肌肉注射給藥3次，A組給予CsA[1mg/(kg·d)]，B組給予CsA[10mg/(kg·d)]，C組給予等量不含藥物的PBS，連續(xù)用藥 10 d。

1.3 臨床觀察排斥反應(yīng)及判斷標(biāo)準(zhǔn) 每組隨機(jī)選定6只大鼠用于臨床排斥評(píng)價(jià)，其余動(dòng)物用于T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。術(shù)后第4天至第21天每天在裂隙燈顯微鏡下觀察術(shù)眼角膜，以后每周觀察兩次，直到100 d。參照Larkin等[6]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，植片混濁0～4級(jí)：0級(jí)為完全透明；1級(jí)為輕度混濁，虹膜紋理清晰可見(jiàn)；2級(jí)為中度混濁，部分虹膜紋理可見(jiàn)；3級(jí)為虹膜紋理不可見(jiàn)，但可見(jiàn)瞳孔；4級(jí)為完全混濁，瞳孔輪廓不清。植片水腫0～2級(jí)：0級(jí)為無(wú)水腫；1級(jí)為中度水腫；2級(jí)為伴有植片增厚的顯著水腫。植片新生血管0～4級(jí)：0級(jí)為無(wú)新生血管；1級(jí)為新生血管在任何象限伸入達(dá)到植片半徑的25%；2級(jí)為新生血管達(dá)到植片半徑的50%；3級(jí)為新生血管達(dá)到植片半徑的75%；4級(jí)為新生血管達(dá)到植片半徑的中央。移植排斥定義為術(shù)后曾經(jīng)透明的移植片出現(xiàn)中等或嚴(yán)重混濁、水腫以及血管化，其中混濁程度≥3，并且總評(píng)分≥5。在100 d后移植片仍能保持透明被視為長(zhǎng)期存活。

1.4 角膜組織學(xué)檢查 各組于術(shù)后第10天隨機(jī)取4只大鼠，過(guò)量麻醉后取右眼角膜，進(jìn)行角膜組織切片的HE染色。

1.5 T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 每組其余大鼠用于取材，術(shù)后10 d處死，收集脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，以5×105細(xì)胞/孔接種于96孔板，在加有10μg/mlConA的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下孵育 66 h，然后每孔加入終濃度為10μmol的BrdU培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)板離心后干燥細(xì)胞，F(xiàn)ixDenat溶液孵育30min，抗BrdU-POD孵育90min，顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，應(yīng)用Kaplan-Meier檢驗(yàn)比較3組植片平均存活時(shí)間,應(yīng)用單因素方差分析比較3組新生血管和T細(xì)胞增殖情況的差異。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 納入33只大鼠，其中1只發(fā)生前房積膿，2只出現(xiàn)白內(nèi)障，予以剔除。

2.2 各組受體大鼠角膜植片的存活情況 A、B組角膜植片的存活時(shí)間與C組比較均顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）,B組優(yōu)于A組（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組受體大鼠角膜植片的存活時(shí)間（n=6,d）

2.3 各組角膜新生血管評(píng)分比較 對(duì)各時(shí)間點(diǎn)3組新生血管評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A、B組新生血管的評(píng)分均低于C組。第6天，C組與A、B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.01)，A組與B組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。其余時(shí)間點(diǎn)，雖然A組的新生血管評(píng)分較C組值低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組與A、C組比較差異有顯著性（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管評(píng)分比較（ ）

表2 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管評(píng)分比較（ ）

a P＜0.05 vs A 組；b P＜0.05 vsB 組

12 d 2.5±1.52 0.816±0.33a 3.17±0.98 b組別A組B組C組6 d 0.17±0.41 0.17±0.41 1.33±1.03 a,b 24 d 3.50±0.84 1.5±1.76 a 4.00±0.00b 18 d 3.33±1.21 1.00±1.26 a 3.83±0.41 b

2.4 各組角膜植片HE染色 見(jiàn)圖1。

2.5 各組受體大鼠脾臟T細(xì)胞增殖情況 對(duì)各組的T細(xì)胞增殖作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A組（0.49±0.07）、B組（0.16±0.03）與 C 組（0.64±0.10）比較有顯著性差異（P＜0.01），A組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

角膜具有眾多特殊的免疫赦免機(jī)制，如缺乏血管、淋巴管以及抗原遞呈細(xì)胞，前房相關(guān)免疫偏離（ACAID）以及CD95L的表達(dá)等，相比其它器官移植手術(shù)，角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生率較低。盡管如此，仍有大約30%的病例會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致5%～7%的病例移植失敗[7-8]。角膜移植排斥反應(yīng)主要是以CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，主要過(guò)程如下：抗原遞呈細(xì)胞（APCs）在促炎性因子、粘附分子以及趨化因子的作用下，由角膜緣以及角膜周邊移行到角膜中央，攝取和處理供體抗原，然后轉(zhuǎn)移至引流淋巴結(jié)，激活初始T細(xì)胞；T細(xì)胞增殖，進(jìn)而分化為效應(yīng)細(xì)胞，攻擊角膜內(nèi)皮，基質(zhì)以及上皮；角膜的免疫赦免機(jī)制被打破，植片基質(zhì)和內(nèi)皮受損，最終導(dǎo)致移植失敗[9-10]。在角膜移植排斥反應(yīng)的治療方面，目前仍然是以糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素A為主。但長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，可導(dǎo)致全身副作用及青光眼、白內(nèi)障等局部并發(fā)癥的發(fā)生[11]。一般認(rèn)為CsA選擇性抑制靜止期輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)的分化增殖，抑制T細(xì)胞由G0期向G1期轉(zhuǎn)變，從而抑制Th細(xì)胞的抗原呈遞過(guò)程，并抑制白介素2（IL-2）和γ-干擾素的產(chǎn)生，減少角膜移植術(shù)后的排斥反應(yīng)[4]。但CsA分子量大，且為疏水性,眼內(nèi)通透性差，影響其局部用藥的療效。

在本研究中，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10mg/(kg·d)CsA與1mg/(kg·d)CsA均能抑制T細(xì)胞增殖，但高劑量組效果更為明顯。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示高劑量組新生血管評(píng)分低于小劑量CsA治療組和空白對(duì)照組。雖然小劑量組的新生血管評(píng)分低于空白對(duì)照組，但除在第6天時(shí)兩者有顯著性差異外，其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10mg/（kg·d）CsA較其它兩組顯著延長(zhǎng)了角膜移植物的存活。

CsA是一種強(qiáng)效免疫抑制劑，是目前治療角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的主要藥物。CsA全身用藥毒性嚴(yán)重，可能引起肝、腎毒性等副作用，限制了其在臨床的應(yīng)用。臨床上主要使用局部滴眼劑的給藥方法，普通的滴眼液通透性差，近年被制成眼膏、眼劑、乳劑、膠原罩、脂質(zhì)體、微粒體、納米等新型眼用制劑。在角膜移植及其它器官移植動(dòng)物模型中，CsA全身應(yīng)用比較多見(jiàn)，但其應(yīng)用的劑量有所不同。本實(shí)驗(yàn)旨在為我們下一步大鼠角膜移植動(dòng)物模型中該藥的使用劑量提供理論依據(jù)。

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