譚天偉，魯吉珂,2，聶開立，張海霞，鄧?yán)?，王?/p>

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029 2 鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450001

酶法合成生物柴油工業(yè)化研究進(jìn)展

譚天偉1，魯吉珂1,2，聶開立1，張海霞1，鄧?yán)?，王芳1

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029 2 鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450001

介紹了北京化工大學(xué)近年來酶法合成生物柴油工業(yè)化研究的結(jié)果。主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：高產(chǎn)脂肪酶菌株的選育、脂肪酶發(fā)酵工藝優(yōu)化及放大、脂肪酶固定化方法、酶反應(yīng)器放大、生物柴油分離精制及副產(chǎn)物甘油綜合利用。該脂肪酶假絲酵母Candidasp. 99-125在5 m3罐發(fā)酵活力不低于8 000 IU/mL，然后將該脂肪酶吸附固定在織物膜上并進(jìn)行表面改性，用于攪拌罐式反應(yīng)器生產(chǎn)每噸甲酯的需酶量?jī)H為4.2 kg，產(chǎn)品經(jīng)分離精制調(diào)質(zhì)后，其各項(xiàng)指標(biāo)完全符合德國(guó)生物柴油生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。副產(chǎn)物甘油可用于1,3-丙二醇發(fā)酵，30 L發(fā)酵罐中1,3-丙二醇的產(chǎn)量可達(dá)到76.1 g/L。

生物柴油，酶催化轉(zhuǎn)化，脂肪酶固定化，1,3-丙二醇聯(lián)產(chǎn)

Abstract:This paper reports the progress of biodiesel production with enzymatic catalysis in Beijing University of Chemical Technology, one of the leaders in biodiesel R & D in China, which includes screening of high-yield lipase production strains,optimization and scale-up of the lipase fermentation process, lipase immobilization, bioreactor development and scale-up, biodiesel separation and purification and the by-product glycerol utilization.Firstly, lipase fermentation was carried out at industrial scale with the 5 m3stirred tank bioreactor, and the enzyme activity as high as 8 000 IU/mL was achieved by the speciesCandidasp.99-125.Then, the lipase was purified and immobilized on textile membranes.Furthermore, biodiesel production was performed in the 5 m3stirred tank bioreactor with an enzyme dosage as low as 0.42%, and biodiesel that met the German biodiesel standard was produced.And in the meantime, the byproduct glycerol was used for the production of 1,3-propanediol to partly offset the production cost of biodiesel, and 76.1 g/L 1,3-propanediol was obtained in 30 L fermentor with the speciesKlebsiella pneumoniae.

Keywords:biodiesel, enzymatic catalysis, lipase immobilization, 1,3-propanediol co-production

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人類對(duì)能源的需求量持續(xù)上升，而在所有能源消費(fèi)中一直居榜首的石化能源儲(chǔ)量有限。從能源安全和環(huán)境保護(hù)的角度考慮，發(fā)展石油替代能源是世界許多國(guó)家緩解能源供應(yīng)緊張、應(yīng)對(duì)氣候變暖(溫室氣體減排)的重要舉措[1]。生物質(zhì)能源除了可再生和清潔外，它是可以直接大規(guī)模生產(chǎn)和替代運(yùn)輸燃料的能源產(chǎn)品，兼有提供能量和物質(zhì)性生產(chǎn)(生物基產(chǎn)品)的功能。生物質(zhì)能以有機(jī)廢棄物或污染物為原料，可實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用與保護(hù)環(huán)境相結(jié)合。

生物柴油(Biodiesel，fatty acid methyl esters)是以油脂和短鏈醇為底物，經(jīng)過酯交換反應(yīng)而得到的脂肪酸短鏈醇酯。生物柴油環(huán)境友好、安全環(huán)保、燃燒性能優(yōu)異，是一種綠色可再生的生物質(zhì)能源。生物柴油中有害物質(zhì)(硫和灰分等)的含量?jī)H為中質(zhì)煙煤的1/10左右，采用生物柴油燃燒尾氣中顆粒物為石化柴油的20%，有毒有機(jī)物排放量?jī)H為1/10，無 SO2、鉛等有毒物質(zhì)的排放。因此，生物柴油的開發(fā)利用是一種高度清潔的能源技術(shù)，是減少溫室氣體排放，防止全球環(huán)境惡化的一種有效選擇。生物柴油也日益成為一種重要的可再生燃料油，用其替代石化柴油已成為國(guó)內(nèi)外能源發(fā)展的必然趨勢(shì)，在我國(guó)也同樣擁有巨大的市場(chǎng)潛力和發(fā)展前景。

目前合成生物柴油最常用的方法是以油脂和短鏈醇類進(jìn)行酯交換反應(yīng)合成脂肪酸短鏈醇酯。酯交換反應(yīng)也稱為醇解，類似于水解的過程，用一種醇置換酯分子中的醇，從而降低底物油脂的粘度。如果甲醇用于上述反應(yīng)中，則稱之為甲醇解。油脂中主要成分是三甘酯，一分子三甘酯與三分子甲醇在催化劑或高溫高壓下酯交換，生成三分子脂肪酸甲酯和一分子甘油，其反應(yīng)可用下面的方程式表示：

醇解反應(yīng)可以由堿、酸或酶催化劑來催化完成。堿催化劑包括 NaOH、KOH、碳酸鹽和鈉、鉀的對(duì)應(yīng)醇類化合物，如甲醇鈉、乙醇鈉等。硫酸、磺酸和鹽酸通常被用作酸性催化劑，脂肪酶也經(jīng)常作為生物催化劑使用。由于堿催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)比酸催化和酶催化的反應(yīng)速率快，反應(yīng)時(shí)間較短，其在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用最廣。但同時(shí)化學(xué)法也有一些缺陷，比如高能耗、甘油分離較困難、催化過程及產(chǎn)物分離精制過程會(huì)產(chǎn)生許多廢液等[2]。

酶法合成生物柴油，是利用脂肪酶能夠催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的功能，完成酯交換反應(yīng)的工藝。酶法具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、可處理多種油脂、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品易提取和精制等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為生物柴油研究的重要發(fā)展方向[3]。但目前制約酶法合成生物柴油的關(guān)鍵在于催化劑脂肪酶的成本較高；底物甲醇、乙醇等短鏈醇對(duì)脂肪酶活力存在著較強(qiáng)的抑制作用，脂肪酶在短鏈醇中容易失活，催化劑的壽命較低；反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物甘油附著在脂肪酶表面，阻礙了底物和催化劑接觸，從而降低反應(yīng)效率。為了提高脂肪酶的操作穩(wěn)定性、降低催化劑使用成本，前人做了大量的研究工作。首先采用各種固定化酶的手段，提高生物催化劑的使用壽命[4]。為了減弱甲醇等短鏈醇對(duì)脂肪酶的毒性，經(jīng)常采用以下 3種策略：甲醇分批加入、溶劑選擇和酰基受體的選擇。其中分批加入甲醇的方式便于實(shí)現(xiàn)，可有效降低甲醇濃度從而提高最終反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，因此應(yīng)用很廣[5]。此外，也有研究者采用叔丁醇體系來改善甲醇和甘油在油脂中的溶解度，避免甲醇毒性和甘油附著，因此該體系中酶操作穩(wěn)定性良好[6]。乙酸甲酯代替甲醇參與反應(yīng)，也可有效避免極性底物對(duì)脂肪酶的毒性，但反應(yīng)速率較慢[7]?？傮w來說，脂肪酶催化合成生物柴油的很多研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，脂肪酶成本仍然較高，高效穩(wěn)定廉價(jià)的脂肪酶的生產(chǎn)和制備仍然是制約工業(yè)化酶法生產(chǎn)生物柴油的關(guān)鍵所在。

本課題組經(jīng)過多年選育，得到了適合脂肪酸酯的專一性的假絲酵母脂肪酶，并開發(fā)出一種新的膜固定化方法，將該脂肪酶固定在織物膜上。該固定化脂肪酶是目前國(guó)內(nèi)外用于酯化反應(yīng)性價(jià)比較好的脂肪酶，大大降低了酶法合成生物柴油的催化劑成本。

1 脂肪酶菌種選育及發(fā)酵生產(chǎn)

首先針對(duì)得到的原始菌株，采用化學(xué)誘變技術(shù)，選育得到高產(chǎn)假絲酵母脂肪酶菌種Candidasp.99-125。根據(jù)脂肪酶的部分氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到脂肪酶成熟肽序列，該脂肪酶成熟肽氨基酸序列由 301個(gè)氨基酸組成。將該序列克隆到pPICZαA載體中，然后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中進(jìn)行脂肪酶的分泌重組表達(dá)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后，利用質(zhì)粒pPICZαA上的Zeocin篩選標(biāo)記，通過高抗生素濃度(500 μg/mL Zeocin)成功篩選得到脂肪酶高產(chǎn)菌株YlLip的2個(gè)多拷貝菌株[8]。搖瓶產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胞外重組脂肪酶活性可達(dá)到350 U/mL；在 5 L發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液中酶活達(dá)到11 000 U/mL，重組蛋白含量達(dá)到了2.3 g/L發(fā)酵液。優(yōu)良菌株的選育和對(duì)應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)高活力脂肪酶奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)利用油脂誘導(dǎo)脂肪酶合成方法，可以顯著提高脂肪酶產(chǎn)量，用界面響應(yīng)方法優(yōu)化了脂肪酶發(fā)酵工藝，小罐脂肪酶產(chǎn)量可達(dá)9 000 IU/mL以上[9]。在1 m3生產(chǎn)罐中成功地進(jìn)行了放大試驗(yàn)，脂肪酶發(fā)酵水平達(dá)到8 200 IU/mL，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步放大至 5 m3發(fā)酵罐，脂肪酶活力均不低于8 000 IU/mL。發(fā)酵水平的提高大大降低了催化劑的成本，脂肪酶的成本已降至60元/kg。

2 脂肪酶固定化

吸附法固定化酶具有操作簡(jiǎn)單、載體便于重復(fù)利用、酶活損失小以及成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是目前最普遍采用的一種固定化方法。我們自主開發(fā)的固定化酶為一種新的膜固定化方法，用廉價(jià)的織物布，經(jīng)過表面改性，將該脂肪酶固定在織物膜上。并進(jìn)一步研究了織物膜表面親疏水性對(duì)固定化酶酶活和穩(wěn)定性的影響，利用疏水界面的活化作用提高固定化酶在有機(jī)相中的催化活性。利用改性劑對(duì)載體進(jìn)行表面處理，提高載體的表面疏水性。經(jīng)表面改性后載體制備的固定化酶，在 10%(V/V)的高含水量體系中仍然保持高催化活力，重復(fù)使用穩(wěn)定性提高1倍，大大提高了生物柴油酶促合成體系中脂肪酶的耐受性。

3 生物柴油反應(yīng)器及放大

在脂肪酶的高效表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建、脂肪酶發(fā)酵工藝優(yōu)化和新型固定化方法的研究基礎(chǔ)上，將該固定化酶布應(yīng)用在生物柴油反應(yīng)器中。將酶布平鋪在36目的不銹鋼絲網(wǎng)上，卷成緊密的筒狀，放入填充床反應(yīng)器中，反應(yīng)器外有夾套通過水浴保持35℃～40℃恒溫。反應(yīng)底物在40℃下充分?jǐn)嚢?，溶解混勻后由反?yīng)器底部打入填充床，反應(yīng)液經(jīng)填充床后由頂部流出。以此種形式填充在減小流體的壓力同時(shí)又起到了液體再分布器的作用。該反應(yīng)器具有操作壓力小、反應(yīng)液體在反應(yīng)器內(nèi)分布均勻、固定化酶利用率高等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于植物油及廢油等原料生產(chǎn)生物柴油轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到90%以上，最高轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96%。在優(yōu)化反應(yīng)條件下，該固定化酶在可連續(xù)使用10 d以上，顯示了良好的操作穩(wěn)定性[10]。

由于該固定化酶催化生物柴油反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，嘗試采用攪拌罐式反應(yīng)器來提高脂肪酶的使用效率。在實(shí)驗(yàn)室5 L三口燒瓶試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將反應(yīng)器放大40倍，攪拌罐體積放大至200 L。投入150 kg原料油，投入480 g酶，在最優(yōu)條件下，產(chǎn)物中甲酯含量為85%。進(jìn)一步將反應(yīng)器放大至1 m3規(guī)模，每次投入原料油818 kg(酸價(jià) 133 mg KOH/g)，固定化酶3.2 kg，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，最終產(chǎn)物酸價(jià)24.97 mg KOH/g，甲酯含量達(dá)到85%。經(jīng)過計(jì)算，該放大實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)每噸甲酯的需酶量為4.2 kg酶/t甲酯，結(jié)果重復(fù)性良好。在工業(yè)規(guī)模5 m3攪拌罐上進(jìn)一步放大，也得到了相似的結(jié)果，表明該方法在工業(yè)上是非常可行的。

4 生物柴油分離及精制

針對(duì)生物柴油的分離精制，采用降膜蒸器發(fā)串聯(lián)刮板式薄膜蒸發(fā)器的工藝。利用降膜蒸發(fā)器來分離除去粗產(chǎn)品的甲醇、水等低沸點(diǎn)物質(zhì)，然后利用刮板式薄膜蒸發(fā)器或分子蒸餾裝置來分離脂肪酸甲酯即生物柴油。該方法分離后產(chǎn)品中甲酯含量大于97%，方法收率大于85%。分離之后的生物柴油粗甲酯，經(jīng)過脫酸、真空脫水，再加入調(diào)制其低溫性能與氧化穩(wěn)定性能的降凝劑抗氧化劑之后，即得到生物柴油產(chǎn)品。該工藝制得的生物柴油，其產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)完全符合德國(guó)生物柴油生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)(表 1)，生產(chǎn)成本同化學(xué)法相當(dāng)，但能耗和三廢排放大大降低。

表1 生物柴油產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)Table 1 Report of the biodiesel product quality

5 副產(chǎn)物甘油高附加值化

為了進(jìn)一步降低生物柴油的生產(chǎn)成本，將副產(chǎn)物甘油進(jìn)行選擇性的脫羥基制備 1,3-丙二醇。以克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae為研究對(duì)象，進(jìn)行了微生物代謝途徑的改造，構(gòu)建了一株高產(chǎn) 1,3-丙二醇的重組克雷伯氏菌。之后將酶催化工段的廢甘油進(jìn)行了預(yù)處理，通過簡(jiǎn)單的減壓蒸餾濃縮除去甲醇。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，經(jīng)過預(yù)處理的甘油溶液可以用于 1,3-丙二醇發(fā)酵，且產(chǎn)物濃度與使用純甘油相當(dāng)。然后在30 L發(fā)酵罐進(jìn)行了批式發(fā)酵，最終發(fā)酵液中 1,3-丙二醇的產(chǎn)量可達(dá)到 76.1 g/L。由此可見，使用生物柴油副產(chǎn)物甘油作為原料用于 1,3-丙二醇發(fā)酵，可以較好地實(shí)現(xiàn)甘油的綜合利用，提高產(chǎn)品的附加值，降低整個(gè)過程的成本。

6 結(jié)論

酶法合成生物柴油因?yàn)槠浞磻?yīng)條件溫和、反應(yīng)過程綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，是近年來研究的熱點(diǎn)。酶法合成生物柴油的關(guān)鍵在于催化劑脂肪酶的活性和穩(wěn)定性。目前研究中應(yīng)用較廣的 Novozym435脂肪酶由于其成本較高，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。我們經(jīng)過多年研究，成功開發(fā)出一種新的高效假絲酵母脂肪酶，通過菌種選育、基因工程菌構(gòu)建、發(fā)酵工藝優(yōu)化及放大，最終在5 m3罐中脂肪酶發(fā)酵活力不低于8 000 IU/mL，脂肪酶的成本僅為60元/kg。采用廉價(jià)的無紡布及絲綢布等，通過表面改性，成功地使脂肪酶固定在廉價(jià)的膜布上，使用完后的膜布洗滌后可重復(fù)使用多次。分別在固定床和攪拌罐中進(jìn)行生物柴油合成反應(yīng)，自制的固定化脂肪酶顯示了良好的催化性能。生物柴油經(jīng)分離精制調(diào)質(zhì)后，其產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)完全符合德國(guó)生物柴油生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)成本同化學(xué)法相當(dāng)，但能耗和三廢排放大大降低。副產(chǎn)物甘油可以經(jīng)過克雷伯氏菌發(fā)酵脫羥基制備1,3-丙二醇，降低整個(gè)生物柴油生產(chǎn)的工藝成本，提高產(chǎn)品附加值。

REFERENCES

[1]Jegannathan KR, Abang S, Poncelet D,et al.Production of biodiesel using immobilized lipase-A critical review.Crit Rev Biotechnol, 2008, 28(4): 253?264.

[2]Lara Pizarro AV, Park EY.Lipase-catalyzed production of biodiesel fuel from vegetable oils contained in waste activated bleaching earth.Process Biochem, 2003, 38(7):1077?1082.

[3]Shimada Y, Watanabe Y, Sugihara A,et al.Enzymatic alcoholysis for biodiesel fuel production and application of the reaction to oil processing.J Mol Catal B:Enzym,2002, 17(3/5): 133?142.

[4]Cao L.Immobilised enzymes: science or art?Curr Opin Chem Biol, 2005, 9(2): 217?226.

[5]Soumanou MM, Bornscheuer UT.Improvement in lipase-catalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil.Enzyme Microb Technol, 2003, 33(1):97?103.

[6]Royon D, Daz M, Ellenrieder G,et al.Enzymatic production of biodiesel from cotton seed oil using t-butanol as a solvent.Bioresour Technol, 2007, 98(3): 648?653.

[7]Xu Y, Du W, Liu D,et al.A novel enzymatic route for biodiesel production from renewable oils in a solvent-free medium.Biotechnol Lett, 2003, 25(15): 1239?1241.

[8]Yu M, Lange S, Richter S,et al.High-level expression of extracellular lipase Lip2 fromYarrowia lipolyticainPichia pastorisand its purification and characterization.Protein Express Purif, 2007, 53(2): 255?263.

[9]He YQ, Tan TW.Use of response surface methodology to optimize culture medium for production of lipase withCandidasp.99-125.J Mol Catal B: Enzym, 2006, 43(1/4):9?14.

[10]Nie K, Xie F, Wang F,et al.Lipase catalyzed methanolysis to produce biodiesel: optimization of the biodiesel production.J Mol Catal B:Enzym, 2006, 43(1/4): 142?147.

Progress on biodiesel production with enzymatic catalysis in China

Tianwei Tan1, Jike Lu1,2, Kaili Nie1, Haixia Zhang1, Li Deng1, and Fang Wang1
1 Beijing Bioprocess Key Laboratory, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China 2 Bioengineering Department, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Received:June 26, 2010;Accepted:July 1, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China(973 Program)(No.2007CB714304), National Nature Science Foundation of China(No.20576013), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(Nos.2006AA020203, 2009AA03Z232),Natural Science Foundation of Beijing(No.2071002).

Corresponding author:Tianwei Tan.Tel: +86-10-64416691; E-mail: twtan@mail.buct.edu.cn國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2007CB714304)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20576013)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(Nos.2006AA020203, 2009AA03Z232)，北京市自然科學(xué)基金(No.2071002)資助。