莫雪梅，高東微

1 暨南大學(xué)藥學(xué)院基因組藥物研究所，廣州 510632

2 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州 510623

生物技術(shù)與方法

SYBR Green I熒光RT-PCR法檢測貝類中的諾如病毒

莫雪梅1*，高東微2*

1 暨南大學(xué)藥學(xué)院基因組藥物研究所，廣州 510632

2 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣州 510623

針對諾如病毒II型的保守區(qū)域設(shè)計引物，建立了SYBR Green I實時熒光RT-PCR檢測諾如病毒II型的反應(yīng)體系。此方法的病毒檢測下限達到102拷貝，標準曲線的線形范圍為102～106拷貝，相關(guān)系數(shù)為0.9952，斜率為?2.982，截距為35.84。對諾如病毒II型檢測特異，與輪狀病毒、腺病毒、甲肝病毒、星狀病毒無交叉反應(yīng)。針對質(zhì)粒標準品檢測的批內(nèi)試驗變異系數(shù) (CV) 為0.95%～1.69% (n=5)，批間試驗CV為0.87%～1.24% (n=3)。運用此方法隨機檢測30份貝類水產(chǎn)品，檢測出2份陽性樣品。結(jié)果表明，SYBR Green I熒光RT-PCR檢測諾如病毒II型的方法靈敏、特異、重復(fù)性好，可應(yīng)用于貝類水產(chǎn)品的快速檢測。

諾如病毒 II型，SYBR Green I熒光 RT-PCR，檢測

Abstract:We set up an SYBR Green I real-time RT-PCR method for the detection of genogroup II Norovirus, and this method’s primers were encompassed the conservative region of Norovirus II. The limit of the detection was 102copies. The standard curve’s linear range was 102–106copies, correlation coefficient was 0.9952, the slope was ?2.982, and the intercept was 35.84. This method possessed specificity for genogroup II Norovirus, without any cross-reaction with rotavirus, adenovirus, hepatitis A virus or astrovirus. The coefficients of variation (CV) of theCtvalues of the standard plasmid were 0.95%–1.69% (n=5) in intra-assay and 0.87%–1.24% (n=3) in inter-assay. We used this method to detect 30shellfish samples, and found 3 samples were positive. This method is sensitive, specific and reliable for Norovirus II. It can be used to detect the Norovirus II in the shellfish rapidly.

Keywords:Norovirus II, SYBR Green I real-time RT-PCR, detection

諾如病毒(Norovirus，NVs) 是人類急性非菌性胃腸炎的最主要病原。近年來，諾如病毒引發(fā)的大規(guī)模腸胃炎事件在世界范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)[1-3]，已成為威脅公共衛(wèi)生安全的重要因素之一。由于水環(huán)境的污染，作為濾食性水生動物的貝類，很容易從污染的水中富集大量食源性病毒。當(dāng)人們生食含有諾如病毒的貝類時，極有可能因感染病毒而誘發(fā)急性腸胃炎。因此，建立貝類水產(chǎn)品中諾如病毒的快速檢測方法，對于保障食品安全非常重要。

諾如病毒根據(jù)其 RNA多聚酶區(qū) (RDRP) 和衣殼蛋白編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列特征，可被分為5個遺傳組 (GG I～V)，其中GG I、GG II和GG IV型可以感染人類[4-5]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，GG II是世界范圍內(nèi)最常見的基因型。我國病人感染的諾如病毒也以GG II為主，GG I及GG IV型較為罕見。

由于諾如病毒迄今尚未能在細胞內(nèi)培養(yǎng)，在早期研究中，電鏡是其唯一的檢測手段，導(dǎo)致食品中相對微量的病毒檢測十分困難。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品中諾如病毒的檢測[6-8]。但是，RT-PCR技術(shù)仍存在靈敏度不高以及易發(fā)生交叉污染等不足。

實時熒光定量PCR是近年新興的分子生物學(xué)技術(shù)，具有直觀、敏感性高、重復(fù)性好、可定量、速度快、操作簡便和污染少等優(yōu)點，已經(jīng)在病毒、微生物、腫瘤基因檢測等方面取得許多成果[9-11]。Real-time PCR技術(shù)主要有TagMan 探針法和SYBR green I 染料法[12-13]。SYBR Green I染料法主要是利用SYBR Green I熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物增加，其熒光信號的增強與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR Green I染料法的優(yōu)勢是無需另外設(shè)計熒光探針，設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。因此，為了提高我國對水產(chǎn)品中諾如病毒的檢測水平，加強對諾如病毒疫情的預(yù)防和控制，本實驗建立了可用于貝類水產(chǎn)品快速檢測GGII型諾如病毒的SYBR green I Real-time PCR方法。

1 材料和方法

1.1 酶和試劑

Viral RNA MiNi Kit購自美國QIAamp公司。逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、ddH2O、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、10×PCR緩沖液購自大連寶生物工程有限公司。小量質(zhì)粒抽提試劑盒和 DNA提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。20×SYBR Green I購自美國Invitrogen公司。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。Agarose Gel DNA Purification Kit和pMD18-T載體購自TaKaRa公司。其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 材料

諾如病毒 II型的質(zhì)粒標準品由廣州市兒童醫(yī)院檢驗科饋贈。甲型肝炎減毒活疫苗由暨南大學(xué)社區(qū)醫(yī)療服務(wù)中心提供。輪狀病毒、腺病毒、星狀病毒陽性糞便標本由廣東省婦幼保健院提供。抽查的 30份貝類水產(chǎn)品樣品于廣州市多個農(nóng)貿(mào)市場隨機采集。

1.3 標準品的制備

將諾如病毒II型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coliTop 10菌株，擴增后用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取，用紫外分光光度計測A260值定量，用ddH2O調(diào)整至 1×1010拷貝/μL，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SYBR Green I熒光RT-PCR法的建立

1.4.1引物的設(shè)計

根據(jù)目前GenBank中所有的諾如病毒cDNA序列，用DNAStar軟件進行同源性比對，選擇高度保守區(qū)域。用Primer Premier 5.0軟件，選擇比較保守的諾如病毒II型的RNA依賴的RNA多聚酶區(qū)與衣殼蛋白區(qū)的連接區(qū)域作為靶向擴增區(qū)域，設(shè)計出熒光定量PCR引物。上游引物：5′-TCTATGTATGGA TCGCACTCG-3′；下游引物：5′-GTAGGCAAGTCC ATCAAAGTC-3′。

1.4.2SYBR Green I熒光RT-PCR的反應(yīng)體系

PCR 反應(yīng)體系 (20 μL)：10× PCR 緩沖液 2 μL，25 mmol/L MgCl22.4 μL，5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，20× SYBR Green I 1 μL，上、下游引物 (20 μmol/L)各 0.5 μL，DNA聚合酶 0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV 0.25 μL，RNAse 抑制劑 0.4 μL，待測模板 8 μL，超純水 3.75 μL。

RT-PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min 逆轉(zhuǎn)錄。95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，52℃退火20s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。于52℃20s退火階段采集熒光信號。

熔解曲線的分析條件：在熒光實時PCR檢測儀Chromo 4 (美國MJ公司) 的系統(tǒng)上，將SYBR Green I熒光實時PCR的產(chǎn)物，設(shè)定為從50℃以0.2℃/s的速度緩慢上升至95℃，連續(xù)收集熒光信號，系統(tǒng)自動繪制熔解曲線。

1.4.3標準曲線的建立

用10倍系列稀釋法處理諾如病毒II型質(zhì)粒標準品。取 6個濃度梯度 (106、105、104、103、102、101拷貝) 諾如病毒 II型質(zhì)粒標準品作為模板，以ddH2O作為陰性對照，分別進行SYBR Green I熒光PCR反應(yīng)。根據(jù)諾如病毒熒光實時PCR的動力學(xué)曲線，檢測儀系統(tǒng)自動生成標準曲線以及回歸方程。

1.4.4SYBR Green I熒光RT-PCR的特異性研究

為了檢驗所建立方法的特異性，我們分別用病毒RNA提取試劑盒提取了輪狀病毒、星狀病毒陽性糞便標本以及甲型肝炎減毒活疫苗的RNA，用DNA提取試劑盒提取了腺病毒的 DNA，并運用 SYBR Green I熒光RT-PCR體系進行檢測。

1.4.5SYBR Green I熒光RT-PCR重復(fù)性和準確性的驗證

為了確定該反應(yīng)體系的重復(fù)性，分別用 4個不同濃度 (103、104、105、106拷貝) 的質(zhì)粒標準品進行了批內(nèi) (5孔重復(fù)試驗) 以及批間 (3批重復(fù)試驗)實驗。為了驗證此反應(yīng)體系的準確性，隨機抽取 3個熒光 PCR陽性樣品的產(chǎn)物，將純化后的 PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 SYBR Green I熒光RT-PCR法檢測貝類的諾如病毒

1.5.1貝類樣品的處理

隨機采集 30份貝類水產(chǎn)品樣品，種類包括花蛤 (菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum)、生蠔 (牡蠣Oyster)、扇貝Placopecta magellanicus、貽貝Mytilus edulis、河蜆Corbicula fluminea。其中，花蛤、貽貝的規(guī)格約為20 g/個；生蠔、扇貝、河蜆的規(guī)格約為100～200 g/個。解剖取下貝類中的腸道組織，取1.5 g樣品加入15 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)，冰上勻漿。將勻漿液置于50 mL離心管中，37℃溫育30 min。4℃、5 000× g離心20 min，收上清液至一新管。按上清液量的10%濃度添加PEG-8000，添加NaCl至終濃度為0.4 mol/L，4℃過夜。次日，離心取沉淀 (10 000× g，5 min，4℃)，向沉淀中加入10 mL Tris-HCl緩沖液，充分溶解后加等量氯仿，室溫振蕩30 min，離心 (2 000×g，30 min，4℃)，取上層水相，?20℃保存待檢。

1.5.2貝類樣品病毒RNA的提取

將以上處理后的樣品液，用病毒RNA提取試劑盒進行常規(guī)RNA提取，提取的RNA立即進行SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)。

1.5.3運用SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法檢測樣品

以提取的病毒RNA作為待測模板，按照以上建立的方法進行檢測。通過樣品在熒光實時PCR檢測儀上生成擴增曲線的Ct值，判斷樣品陰性或陽性。

2 結(jié)果

2.1 SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)體系的建立

不同濃度的諾如病毒II型質(zhì)粒標準品的動力學(xué)曲線見圖1。結(jié)果顯示，濃度在102拷貝以上的標準品有明顯的熒光增長，而 101拷貝和陰性對照均無熒光增長，因此該熒光 RT-PCR檢測體系的病毒檢測下限為102拷貝。

在Chromo 4熒光實時PCR檢測儀上結(jié)束擴增后，用系統(tǒng)上Opticon Monitor (version 3.1) 軟件進行分析，以起始模板的對數(shù)為x軸，以Ct值為y軸作回歸曲線，即得諾如病毒檢測的標準曲線 (圖2)。該標準曲線的相關(guān)系數(shù)為 0.9952，斜率為?2.982，截距為35.84。標準曲線在102～106拷貝范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系。

2.2 SYBR Green I熒光RT-PCR的特異性

從圖3中質(zhì)粒標準品的熒光RT-PCR熔解曲線分析，濃度在 102～106拷貝的質(zhì)粒的 PCR產(chǎn)物熔解峰特異，Tm值為85℃±0.1℃，沒有其他明顯的雜峰出現(xiàn)；濃度為 101拷貝的質(zhì)粒以及陰性對照均沒有出現(xiàn)溶解峰。說明沒有產(chǎn)生由引物二聚體引起的假陽性擴增信號，反應(yīng)體系的特異性高。

圖1 SYBR Green I熒光定量PCR法的動力學(xué)曲線Fig.1 Dynamic curve of the real-time RT-PCR for Norovirus.1–6: GII Norovirus plasmid standards containing from 106to 101copies per reaction; 7: negative control.

圖2 SYBR Green I熒光定量PCR法的標準曲線Fig.2 Standard curve of the real-time RT-PCR for Norovirus.

從圖4中不同病毒的擴增曲線可以看到，只有諾如病毒II型質(zhì)粒標準品有明顯的熒光增長，其他病毒 (包括輪狀病毒、腺病毒、星狀病毒、甲型肝炎病毒) 均無熒光增長，說明該方法能特異擴增GG II諾如病毒。

2.3 SYBR Green I熒光PCR檢測的重復(fù)性和準確性

圖3 SYBR Green I熒光定量PCR法的熔解曲線Fig.3 Melting curve of the real-time RT-PCR for Norovirus.1–6: GII Norovirus plasmid standards containing from 106to 101copies per reaction; 7: negative control.

圖4 SYBR Green I熒光定量RT-PCR體系對不同病毒的擴增曲線Fig.4 Amplification curves of the real-time RT-PCR system for different viruses. 1: GII Norovirus plasmid standard; 2:rotavirus; 3: hepatitis A virus; 4: adenovirus; 5: astrovirus.

表1中的數(shù)據(jù)顯示，4個不同濃度的質(zhì)粒標準品(106、105、104、103拷貝) 所進行的批內(nèi)試驗 (n=5) 的Ct值變異系數(shù) (CV) 分別為1.02%、1.69%、0.95%、1.13%，批間試驗 (n=3) 的Ct值變異系數(shù) (CV) 分別為0.90%、1.18%、1.24%、0.87%。上述結(jié)果表明，在相同實驗條件下，SYBR Green I熒光PCR檢測體系的重復(fù)性好。隨機抽取3個陽性PCR產(chǎn)物進行委托測序，測序結(jié)果顯示全部為GG II型諾如病毒，說明所建立的熒光PCR檢測體系準確可靠。

表1 Real-time PCR檢測的批內(nèi)和批間試驗的Ct值及其變異系數(shù)Table 1Ctvalues and coefficients of variation (CV) of intra-assay and inter-assay of the real-time PCR

2.4 SYBR Green I熒光定量RT-PCR法檢測貝類抽樣樣品

為了評價所建立的熒光 RT-PCR法的實用性，我們運用此方法檢測了 30份于廣州市多個農(nóng)貿(mào)市場隨機采集的貝類水產(chǎn)品。檢測結(jié)果顯示，30份樣品中有 2份呈陽性 (7%)，均為牡蠣，其Ct值分別為26.95、27.32；其余28份抽樣樣品呈陰性 (圖5)。

圖5 SYBR Green I熒光定量RT-PCR法檢測30份抽樣水產(chǎn)品的擴增曲線Fig.5 Amplification curves of the real-time RT-PCR system for 30shellfish samples. 1: positive sample (Oyster); 2: positive sample (Oyster); 3: negative samples.

3 討論

近年來，諾如病毒感染日益成為一個全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。受污染的貝類是諾如病毒一個重要傳染源。因此，建立貝類中諾如病毒靈敏的檢測方法，對于保障人們的健康和預(yù)防疫情的爆發(fā)具有重要意義。本實驗采用SYBR green I染料法建立了諾如病毒的熒光RT-PCR檢測體系。

SYBR Green I濃度是影響實驗的關(guān)鍵因素之一，如果濃度過低會導(dǎo)致熒光信號強度不夠；而過高濃度則會抑制PCR反應(yīng)[14]。本實驗所用的SYBR Green I染料為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，生產(chǎn)商建議SYBR Green I終濃度為1×。此外，本文所建立的反應(yīng)體系中，Mg2+濃度達到 3 mmol/L，高于常規(guī)RT-PCR體系中Mg2+濃度 (0.5～2.0 mmol/L)，適當(dāng)提高Mg2+濃度可以有效降低SYBR Green I對PCR反應(yīng)的抑制作用。

引物二聚體引起的熒光信號會對結(jié)果產(chǎn)生較大影響，必須盡量消除引物二聚體的干擾。提高退火溫度可消減二聚體產(chǎn)生，但同時也會導(dǎo)致擴增效率下降[15]。本實驗在查閱文獻[16]以及預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，最終將退火溫度設(shè)定為52℃。SYBR green I 熒光定量PCR理想擴增產(chǎn)物應(yīng)在100 bp以下[17]，本實驗所設(shè)計的引物選擇了諾如病毒II型保守區(qū)域，擴增片段長度為95 bp，符合此要求。

本實驗所建立的 SYBR green I熒光定量RT-PCR法，GG II NVs病毒檢測下限達到102拷貝，比常規(guī)RT-PCR的靈敏度 (檢測下限約103拷貝)[18-19]提高10倍左右。為了實現(xiàn)病毒的富集，水產(chǎn)品需要經(jīng)過預(yù)處理的過程，預(yù)處理過程需在4℃過夜的條件下進行。在完成水產(chǎn)品的預(yù)處理后，如果采用常規(guī)RT-PCR法，從病毒核酸提取到RT-PCR及電泳檢測約需要6 h，而采用該方法從病毒核酸提取到完成檢測僅需要約3 h。該方法實行閉管式操作，PCR產(chǎn)物不會污染環(huán)境。熔解曲線分析表明，反應(yīng)體系的PCR產(chǎn)物熔解峰特異，沒有明顯的雜峰出現(xiàn)，基本消除引物二聚體的干擾。特異性實驗表明，該方法對諾如病毒II型檢測特異，與輪狀病毒、腺病毒、甲肝病毒、星狀病毒無交叉反應(yīng)。針對質(zhì)粒標準品檢測的批內(nèi)試驗和批間試驗表明，所建立的檢測體系重復(fù)性好。運用此SYBR green I熒光定量RT-PCR檢測每份樣品的成本約為25元 (人民幣)，比TagMan探針法價格更適宜。因此，本實驗所建立的SYBR green I熒光定量RT-PCR法具有靈敏、快速、特異、穩(wěn)定、經(jīng)濟的優(yōu)點，可適用于大規(guī)模水產(chǎn)品中諾如病毒II型的檢測。

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SYBR Green I real-time polymerase chain reaction for detection of Norovirus II in the shellfish

Xuemei Mo1*, and Dongwei Gao2*

1Institute of Genome Medicine,Jinan University,Guangzhou510632,China
2Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center,Guangzhou510623,China

Received:January 5, 2010;Accepted:March 23, 2010

Supported by:Scientific and Technological Project of Guangdong Province (No. 2005B20401017), Scientific and Technological Project of Guangdong Inspection and Quarantine Office (No. 2005AGDK28).

Corresponding author:Dongwei Gao. Tel/Fax: +86-20-33320663; E-mail: mxm200101@163.com

*These authors contributed equally to this study.

廣東省科技攻關(guān)項目 (No. 2005B20401017)，廣東檢驗檢疫局科技項目 (No. 2005AGDK28) 資助。