石豐運，繆建錕，張利平，陶虹，呂建強，阮周曦，宗卉

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070

2 深圳出入境檢驗檢疫局，深圳 518010

3 中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193

生物技術(shù)與方法

運用基因芯片技術(shù)檢測牛、山羊、豬和雞源性成分

石豐運1,2，繆建錕3，張利平1，陶虹2，呂建強2，阮周曦2，宗卉2

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070

2 深圳出入境檢驗檢疫局，深圳 518010

3 中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193

本研究通過對脊椎動物分子標記基因進行序列分析，最終選擇線粒體DNA (mtDNA) 16S rRNA基因為目標基因，利用一對通用引物，在該引物擴增區(qū)間設(shè)計了4條特異性基因芯片檢測探針及2條質(zhì)控探針用于對牛、山羊、豬、雞等4種動物源性成分進行檢測。通過對PCR擴增體系及雜交體系的優(yōu)化，該檢測方法能實現(xiàn)對上述4種動物源性成分同時進行快速、準確地檢測，具有很好的特異性，靈敏度均達到1 pg，最終建立了這4種動物源性基因芯片檢測方法。該基因芯片檢測技術(shù)將為我國進出口飼料中的動物源性成分的鑒別提供新的檢測方法和技術(shù)支持。

線粒體16S rRNA基因，DNA芯片，動物源性

Abstract:We analyzed the sequence of vertebrate molecular marker genes, then we selected the mitochondrial DNA (mtDNA)16S rRNA gene as marker gene. In order to detect four kinds of animal-derived ingredients, which including bovine, goat, pig and chicken. We utilized a pair of universal primers, designed four sets of species-specific microarray probes and two pairs of quality control probes. We optimized the PCR amplifications and hybridization conditions, therefore these four kinds of animal-derived ingredients could be rapid and accurate detected by this approach. The detection limits were all reaches 1 pg. We established the detection platform of these four kinds of animal-derived ingredients. This universal PCR-microarray assay provides a new method for the identification of animal-derived ingredients in the import-export field.

Keywords:mitochondrion 16S rRNA gene, DNA chip, animal-derived ingredients

隨著國際貿(mào)易的飛速發(fā)展，防御國際間動物疫病傳播的難度也在不斷加大。為了防止瘋牛病、癢病、禽流感、甲流等經(jīng)飼料、畜產(chǎn)品傳播，世界各國政府和組織在規(guī)范對動物源性飼料使用的同時，積極開展動物源性成分檢測技術(shù)方面的研究。目前國內(nèi)外對于動物源性成分的檢測方法的報道主要有顯微鏡檢法、紅外光譜、ELISA、普通 PCR、熒光定量PCR等方法。但上述的分子生物學方法尚不能很好滿足快速、大規(guī)模、高通量檢測的需要。因此，需要建立一種能快速準確鑒別、檢測動物源性成分的方法，提高檢驗檢疫通關(guān)速度，對保護我國畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)具有重要的意義。

基因芯片基本原理是將核酸片段作為識別分子，按預先設(shè)置的排列固定于特定的固相支持載體的表面形成微點陣，利用反向固相雜交技術(shù)，將標記的樣品分子與微點陣上的核酸探針雜交，以實現(xiàn)多到數(shù)萬個分子之間的雜交反應(yīng)，通過特殊的檢測系統(tǒng)進行高通量、大規(guī)模地分析檢測樣品中多個基因的表達狀況或者特定基因分子的存在[1]?；蛐酒蚓哂懈咄?、高度并行性、高靈敏度等優(yōu)點而得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]?；蛐酒壳爸饕a(chǎn)品包括基因表達譜芯片，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測芯片，新生兒基因檢測芯片，肝炎病毒、艾滋病毒基因檢測芯片，其中腫瘤檢測、肝病檢測、自身免疫疾病診斷芯片即將或已經(jīng)進入臨床應(yīng)用和商業(yè)化運作。物種鑒定檢測芯片研制仍處于起步階段，如應(yīng)用于臨床致病真菌鑒定[4]和水產(chǎn)食品中常見病原微生物鑒定[5]等。但迄今為止，基因芯片技術(shù)應(yīng)用于動物源性成分鑒定檢測還未見報道。因此，本研究嘗試建立用基因芯片技術(shù)同時對牛、山羊、豬、雞 4種動物成分的快速檢測方法，較好地彌補了常規(guī)分子檢測方法的缺陷，能實現(xiàn)一次反應(yīng)完成對多種動物源性成分的種類初篩和鑒定，為我國進出口飼料及畜產(chǎn)品快速篩查和種類鑒定提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

牛肉、山羊肉、豬肉、雞肉、綿羊肉、狗肉、兔肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉、火雞肉、鷓鴣肉和魚肉均購自廣東深圳超市，驢肉和鹿肉均購自內(nèi)蒙古呼和浩特超市。這些樣品均經(jīng)過品種鑒定并測序驗證，結(jié)果證明均為其名稱所述之物種。

1.2 試劑和儀器

細胞/組織-基因組提取試劑盒購自北京天根生物公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000購自寶生物工程 (大連) 有限公司。醛基化DNA芯片基片及蓋片、4孔圍欄購自北京博奧生物公司。

NANO-PLOTTER2芯片點樣儀、GenePix4200A芯片掃描儀、ABI Verti PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、烘箱 (BINDER)、核酸蛋白分析儀DU800 (Beckman) 均由深圳出入境檢驗檢疫局動植中心提供。

1.3 引物和探針的設(shè)計

根據(jù)相關(guān)檢測文獻及對牛、山羊、豬、雞、魚等動物的DNA分子標記基因序列進行系統(tǒng)分析，最終選擇mtDNA 16S rRNA基因為目標基因。根據(jù)文獻選用了一對可擴增該基因的通用引物 Universal-Forward/Reverse[6]，在引物的擴增區(qū)間設(shè)計出一系列探針，用于檢測牛、山羊、豬、雞源性成分。將候選探針序列用 GenBank的 Blastn軟件進行比對分析，并進行實驗驗證，經(jīng)過篩選選擇了特異性較好的序列作為固相芯片檢測探針，質(zhì)控探針包括陽性定位點探針及Cy5標記互補鏈、陰性質(zhì)控探針。質(zhì)控探針均與牛、山羊、豬、雞、魚以及馬等動物mtDNA的16S rRNA基因序列無同源性。引物和探針的合成、修飾由上海超世生物技術(shù)有限公司完成，具體序列見表1。

1.4 芯片的制備

固相探針用1× TE溶解至終濃度為40 μmol/L，與 50% DMSO等體積混勻后作為探針點樣混合液，加入384孔板中，空白對照為50% DMSO，按預先設(shè)計的探針點陣排布順序，點樣至基片上。點樣后基片在濕盒中37℃烘箱中水合12 h，用 0.2%SDS洗液漂洗2 min，去離子水漂洗3次，每次2 min。再放入0.2% NaBH4封閉液中封閉15 min，中間靜置5 min；去離子水漂洗3次，每次2 min，2 000 r/min離心2 min干燥，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因芯片的陣列設(shè)計

每張醛基化玻片上固定著4個矩陣，探針點陣排布如圖1所示，每個陣列共4行11列，第1列和第1行均為陽性定位點探針，其他探針各設(shè)5個重復。

表1 動物源性基因芯片通用引物、檢測探針和質(zhì)控探針Table 1 Universal primers, species- specific probes and quality control probes used in this study

圖1 基因芯片探針排布圖Fig.1 Layout of microarray probes. A: anchor probe; N: negative probe; B: blank control.

1.6 熒光摻入法PCR擴增與標記

熒光摻入法PCR反應(yīng)體系為：10× PCR buffer 2.5 μL、Mg2+2 μL、正向引物和反向引物各 0.5 μL(10 μmol/L)、Taq酶 0.2 μL (5 U/μL)、Cy5-dNTPs 0.4 μL、DNA 模板 (10 ng/μL) 1 μL、ddH2O 補足總體積到25 μL?？瞻讓φ諡閐dH2O代替DNA。PCR擴增條件為：94℃預變性 5 min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸 5 min。Cy5-dNTPs 配方為 ddH2O 2.85 μL、dATP(10 mmol/L) 1 μL、dCTP (10 mmol/L) 1 μL、dGTP(10 mmol/L) 1 μL、dTTP (10 mmol/L) 0.65 μL、Cy5-dCTP (1 mmol/L) 3.5 μL。

1.7 雜交及掃描

分別取 7 μL 芯片雜交液 (5× SSC，0.1% SDS)，6 μL PCR標記產(chǎn)物、Cy5標記陽性定位探針互補鏈1 μL，混勻后95℃變性5 min，立即冰浴5 min。將其按預計排布順序加入芯片點樣區(qū)，蓋上蓋玻片置于雜交盒中52℃烘箱中避光雜交2 h。雜交后的芯片依次放入42℃預熱洗液I (0.3× SSC，0.2%SDS)和洗液 II (0.06× SSC) 磁力攪拌清洗，各 3 min，2 000 r/min離心2 min干燥。激光共聚焦掃描儀設(shè)置為在635 nm的激發(fā)波長掃描芯片，激光功率為60%，PMT設(shè)置為60%進行掃描。圖像用GenePixs V5.0軟件分析，以JPEG和TIFF的格式保存。

1.8 特異性實驗

為了更好地評價本檢測方法的特異性，共選取15種不同種的動物組織 (見 1.1)，用通用引物Universal-Forward/Reverse進行熒光摻入法 PCR擴增，擴增后產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，雜交、掃描過程見1.7。

1.9 靈敏度實驗

將提取的牛、山羊、豬、雞的DNA模板原液測量濃度后母液均定量至 10 ng/μL，分別進行 10×梯度稀釋，即 10?1～10?6共 6個梯度。用通用引物Universal-Forward/Reverse進行熒光摻入法 PCR擴增，擴增后產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，雜交、掃描過程見1.7。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因片段熒光摻入法PCR擴增結(jié)果

分別用牛、山羊、豬、雞、綿羊、鹿、驢、狗、兔、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、鷓鴣、魚等15種動物源性DNA模板和空白對照進行熒光摻入法PCR擴增，電泳檢測結(jié)果見圖 2。通用引物 Universal-Forward/

圖2 通用引物動物源性PCR擴增電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis analysis of PCR products by primers Universal-Forward/Reverse. M: DNA marker DL 2 000; 1?16:bovine, goat, pig, chicken, sheep, donkey, deer, dog, rabbit, duck, goose, quail, turkey, artridge, fish, blank control.

Reverse能有效擴增出以上15種動物源性的DNA模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，回收純化并測序，結(jié)果表明15種動物源性PCR產(chǎn)物序列長度分別在234～249 bp之間，與預期擴增產(chǎn)物大小相同，空白對照無擴增條帶。同時，用該通用引物對牛源性成分進行靈敏度檢測，電泳結(jié)果見圖 3，牛 DNA濃度為10?5稀釋度時，5 μL PCR產(chǎn)物通過電泳已經(jīng)看不到電泳條帶。

2.2 基因芯片特異性檢測結(jié)果

圖3 靈敏度實驗PCR電泳圖Fig.3 Agarose electrophoresis analysis of sensitivity test of bovine by Universal-Forward/Reverse. M: DNA marker DL 2 000; 1?6: 10?1, 10?2, 10?3, 10?4, 10?5, blank control.

圖4 特異性檢測雜交結(jié)果Fig.4 Specificity test result of microarray. A?O: bovine, goat, pig, chicken, donkey, deer, dog, rabbit, duck, goose, artridge, quail,turkey, sheep, fish, respectively.

用通用引物進行熒光摻入法標記PCR擴增，按1.7方法進行雜交、掃描，結(jié)果如圖4所示。為了能有效地對雜交信號進行評判，在根據(jù)文獻[7]得出本系統(tǒng)的陽性判定標準為通過Gene Pix 4200A掃描識別的信噪比大于3的信號為陽性信號。陽性質(zhì)控探針及陰性質(zhì)控探針雜交信號正常，4條特異性探針與目的產(chǎn)物有很好的雜交信號，與其余11種供試材料之間無雜交信號，不存在交叉反應(yīng)，這4條特異性探針有很好的特異性。

2.3 基因芯片靈敏度檢測結(jié)果

用通用引物進行熒光摻入法標記PCR擴增，按1.7方法進行雜交、掃描，牛、山羊、豬、雞源性成分的基因芯片靈敏度檢測結(jié)果分別見圖 5～8，最低檢測限都達到了10?5稀釋度，即濃度為1 pg。牛源性成分靈敏度檢測電泳結(jié)果表明 (圖3)，牛DNA濃度為10?5稀釋度時，5 μL PCR產(chǎn)物通過電泳已經(jīng)看不到電泳條帶 (山羊、豬、雞電泳結(jié)果與?；疽恢?，但是通過基因芯片雜交后仍然可以看到較為明顯的雜交信號 (圖5)。

2.4 基因芯片檢測方法可重復性驗證

從2批點制的檢測芯片中各隨機抽取4張，針對bovine和goat探針位點的靶基因做2次雜交，每次再從2批次芯片中隨機抽取2張雜交，所用靶基因的量 (10 ng/μL) 及雜交條件都是相同的，用以驗證該方法的重復性和穩(wěn)定性。第 1次雜交各芯片標記為 1A、1B、2A、2B；第 2次雜交各芯片標記為1C、1D、2C、2D。從雜交掃描分析后的圖像上可以看出，無論是批間還是批次雜交試驗都得到了明顯的信號結(jié)果 (圖9)，而且各個探針間也沒有交叉反應(yīng)。

圖5 基因芯片對牛成分的靈敏度檢測結(jié)果Fig.5 Sensitivity test result of bovine by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖6 基因芯片對山羊成分的靈敏度檢測結(jié)果Fig.6 Sensitivity test result of goat by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖7 基因芯片對豬成分的靈敏度檢測結(jié)果Fig.7 Sensitivity test result of pig by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖8 基因芯片對雞成分的靈敏度檢測結(jié)果Fig.8 Sensitivity test result of chicken by microarray. (A) 10?1. (B) 10?2. (C) 10?3. (D) 10?4. (E) 10?5. (F) 10?6.

圖9 可重復性雜交試驗結(jié)果Fig.9 Repeatability results of hybrization. 1A, 1B, 1C, 1D: bovine; 2A, 2B, 2C, 2D: goat.

3 討論

mtDNA是高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，所有組織細胞中均含有大量的線粒體[8]，mtDNA主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少，而在不同的物種間具有高度的變異性[9]。在高等植物中沒有發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu)的基因，在植物mtDNA中也沒有相似的編碼同源蛋白的基因[10-11]，因此，高等生物mtDNA 16S rRNA是一個比較理想的、保守性較好的分子標記基因。本研究通過該區(qū)段的一對通用引物Universal-Forward/Reverse可以對 15種脊椎動物mtDNA 16S rRNA基因進行有效擴增，結(jié)合特異性探針，構(gòu)建固相基因芯片，可同時進行多種動物源性成分的鑒別檢測，不僅可以降低檢測步驟及時間，還可降低檢測成本。

獲得具有很好特異性和高靈敏度的探針是成功建立基因芯片檢測技術(shù)的關(guān)鍵[12-14]，因此如何進行探針的設(shè)計與篩選來消除探針雜交的不利影響，提高檢測的特異性將是基因芯片應(yīng)用技術(shù)研究的重點之一[15-16]。在探針篩選過程中，本實驗發(fā)現(xiàn)探針的Tm值及雜交溫度[17]和探針在 PCR產(chǎn)物序列上的位置對雜交信號的強弱有著較為明顯的影響。雜交溫度降低將增加探針的信號值，但探針的特異性將降低；雜交溫度提高將降低探針的信號值，但探針的特異性將提高，而最佳的雜交溫度一般低于探針的理論Tm值8℃～10℃，通過對雜交溫度進行系統(tǒng)的梯度性優(yōu)化試驗獲得最佳的雜交溫度。由于探針的位置對特異性也有影響，在靠近PCR產(chǎn)物5′端的位置時，反向探針的雜交信號要好于正向的探針。當所設(shè)計的探針的位置在靠近PCR產(chǎn)物中間的位置時，正向探針的雜交信號與反向探針雜交信號相近[18]，所以在設(shè)計探針時要考慮探針的選擇位點及方向性。

本研究在進行基因芯片靈敏度檢測方法過程中，發(fā)現(xiàn) 10?5梯度稀釋的牛 DNA通過瓊脂糖凝膠電泳無目的產(chǎn)物，但是通過基因芯片雜交后有雜交信號，說明基因芯片檢測方法的靈敏度要高于常規(guī)PCR，這一研究結(jié)果與翟俊輝等[19]的研究結(jié)果相符。

本研究選取通用引物只通過一次PCR擴增就可以得到 15種動物的目的片段，結(jié)合PCR-基因芯片技術(shù)可同時鑒別檢測多種動物源性成分，并且具有很好的特異性和靈敏度。通過對牛、山羊、豬和雞動物源性成分檢測方法的初步研究，獲得了該體系PCR擴增及芯片雜交等步驟的參數(shù)，為進一步對其余的動物源性成分的檢測奠定了基礎(chǔ)。本方法大大地縮短了檢測周期，為口岸檢驗檢疫提供高效、快速、準確的檢測手段，為我國進口食品、畜產(chǎn)品快速篩查和種類鑒定提供有效的技術(shù)平臺，具有非常廣闊的推廣應(yīng)用前景。

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Detection of bovine, goat, pig and chicken derived ingredients in animal products with universal PCR-microarray method

Fengyun Shi1,2, Jiankun Miao3, Liping Zhang1, Hong Tao2, Jianqiang Lü2, Zhouxi Ruan2,and Hui Zong2

1Faculty of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China
2Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen518010,China
3State Key Laboratory of Agro-biotechnology,China Agricultural University,Beijing100193,China

Received:January 14, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:Project of Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau (No. SZ2008015).

Corresponding author:Hui Zong. Tel: +86-755-25588685; E-mail: zonghui32@yahoo.com.cn

深圳出入境檢驗檢疫局科研項目 (No. SZ2008015) 資助。