李小波, 康立功, 路 盼, 張 賀, 李景富

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄研究所,哈爾濱 150030)

番茄葉霉病是番茄的主要病害之一,在歐洲、美洲、亞洲、大洋洲、非洲都有該病發(fā)生的報(bào)道,在我國以華北和東北地區(qū)受害最為嚴(yán)重[1]。番茄葉霉病是由半知菌亞門黃枝孢菌引起的真菌性病害,具有間歇暴發(fā)的特點(diǎn)。近年來,番茄普遍采取保護(hù)地種植方式,而保護(hù)地環(huán)境條件客觀上促進(jìn)了葉霉病的大規(guī)模發(fā)生和流行,因此該病害在保護(hù)地有逐年加重的趨勢[2],目前,已成為保護(hù)地番茄高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素。

番茄葉霉病菌分泌的毒素是導(dǎo)致葉霉病發(fā)生及給番茄造成傷害的關(guān)鍵生化因子[3],因此探明番茄葉霉病菌分泌毒素的條件,有利于番茄抗/感葉霉病菌生化機(jī)理的研究和篩選、鑒定番茄抗葉霉病種質(zhì)資源。前人研究結(jié)果表明:番茄葉霉病菌產(chǎn)生毒素為多組分糖蛋白[4],該毒素對番茄組織細(xì)胞具有明顯的損傷作用,主要包括:誘導(dǎo)葉組織壞死,加速胼胝質(zhì)沉積和電解質(zhì)滲漏,提高脂加氧酶活性和脂質(zhì)過氧化作用等[5-6]。

番茄葉霉病菌具有明顯的生理分化現(xiàn)象,至少有13個(gè)生理小種已被報(bào)道[7]。目前,國內(nèi)外對番茄葉霉病菌的研究,僅限于番茄葉霉病菌的分離、純化和生理小種鑒定等;而有關(guān)番茄葉霉病菌毒素的產(chǎn)生條件國內(nèi)外均鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所保存的番茄葉霉病菌生理小種1.2.3.4及番茄感病品種東農(nóng)704為研究材料,系統(tǒng)詳盡地對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒條件、提取方法、濃度測定及生物學(xué)活性分析方法進(jìn)行了研究,以期為番茄抗葉霉病育種奠定基礎(chǔ)和提供現(xiàn)實(shí)條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

番茄葉霉病菌生理小種1.2.3.4及番茄感病品種東農(nóng)704,均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)液種類

在無菌條件下,分別采用 Czapek、改進(jìn)的Czapek、Fries、Richard 、PS 、PD 6 種培養(yǎng)液,培養(yǎng)液配方見文獻(xiàn)[8],放入直徑為8mm的菌碟5片,pH 7,25℃振蕩培養(yǎng)20 d,3次重復(fù)。

1.2.2 pH

在無菌條件下,分別在 pH 3、5、6、7、9的 PS 培養(yǎng)液中,放入直徑為8mm的菌碟5片,25℃恒溫振蕩培養(yǎng)20 d,3次重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間

在無菌條件下,分別在pH7的PS培養(yǎng)液中放入直徑為8mm的菌碟5片,25℃恒溫振蕩培養(yǎng)7、14、21 d和28 d,3次重復(fù)。

1.2.4 溫度

在無菌條件下,分別在pH7的PS培養(yǎng)液中放入直徑為8mm 的菌碟5 片,分別在 22、24、26、28、30℃及34℃下振蕩培養(yǎng)20 d,3次重復(fù)。

1.2.5 培養(yǎng)方式

在無菌條件下,在pH 7的PS培養(yǎng)液中放入直徑為8 mm的菌碟5片,分別在25℃下進(jìn)行靜止培養(yǎng)、每天振蕩12 h培養(yǎng)和全天振蕩培養(yǎng)20 d,3次重復(fù),定時(shí)測定毒素濃度。

1.2.6 光照

在無菌條件下,在pH 7的PS培養(yǎng)液中放入直徑為8 mm的菌碟5片,分別在25℃下振蕩培養(yǎng)20 d,設(shè)黑暗、每天光照12 h和24 h共3個(gè)處理,3次重復(fù),定時(shí)測定毒素濃度。

1.2.7 菌碟數(shù)

在無菌條件下,分別在pH7的PS培養(yǎng)液中放入3、5、7碟直徑為8 mm的菌碟,在25℃下振蕩培養(yǎng)20 d,3次重復(fù),定時(shí)測定毒素濃度。

1.3 葉霉病菌粗毒素的提取與濃度的測定

1.3.1 毒素蛋白的提取

參照陳旭升[9]介紹的方法,略作改進(jìn)。具體為:將上述培養(yǎng)的菌液在無菌條件下,每樣品每次吸取5m L,5 000 r/min離心15m in,取上清液,再經(jīng)濾膜(d=0.45μm)過濾,粗毒素濾液做顯微觀察,確定無菌后用 90%飽和度硫酸銨沉淀過夜。再經(jīng)15 000 r/min離心20 min,棄上清液得蛋白質(zhì)粗提物。用0.05 mol/L磷酸緩沖液含有0.15 mol/L NaCl(pH=7.0)溶解蛋白質(zhì),15 000 r/min離心5 min,得上清蛋白質(zhì)溶液。

1.3.2 毒素蛋白的濃度測定

按考馬斯亮藍(lán)G-250法[10],以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),在722分光光度計(jì)上595 nm處測定濾液中的毒素蛋白濃度,以磷酸緩沖液作對照。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 葉霉病菌毒素生物測定

種子萌發(fā)法[3]:種子在40℃水中浸泡4 h,用0.1%高錳酸鉀浸泡15 min。將種子放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿放50粒,分別各自加入上述7個(gè)濃度的毒素液2m L,然后每日加1m L,并透氣1 h,置于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),以未接菌的培養(yǎng)液作對照。5 d后測其萌發(fā)率,計(jì)算萌發(fā)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)液對產(chǎn)毒的影響

由圖2可以看出,培養(yǎng)液對病菌產(chǎn)毒有很大的影響,其中以在PS液體培養(yǎng)液中產(chǎn)毒量最高,并且種子萌發(fā)抑制率最高達(dá)88%;其次是PD液體培養(yǎng)液;在Czapek、Richard這2種培養(yǎng)液中幾乎不產(chǎn)毒素,說明它們是最不適合產(chǎn)毒的培養(yǎng)液。

圖2 培養(yǎng)液的種類對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的影響

2.2 pH對產(chǎn)毒的影響

由圖3可以看出,培養(yǎng)液pH對病菌產(chǎn)毒有一定的影響,偏酸性的環(huán)境有利于產(chǎn)毒,pH為6時(shí),毒性最強(qiáng),種子萌發(fā)抑制率也達(dá)到最大為82%。

圖3 pH對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的影響

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)毒的影響

由圖4可以看出,從第7天到第21天產(chǎn)毒增長量都很明顯,第28天趨于平緩。雖然第21天的粗毒素蛋白含量比第28天稍低一點(diǎn),但是它的種子萌發(fā)抑制率達(dá)到最大為94%,所以21天為最適培養(yǎng)時(shí)間。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的影響

2.4 溫度對產(chǎn)毒的影響

由圖5可以看出,溫度對產(chǎn)毒量有一定的影響,溫度偏高或偏低都不利于產(chǎn)毒,以26℃產(chǎn)毒量最多,種子萌發(fā)抑制率也最高,這可能跟菌絲產(chǎn)毒時(shí)所需酶的活性有關(guān),28、30℃產(chǎn)毒量與種子萌發(fā)抑制率僅次于26℃,所以產(chǎn)毒的最佳溫度范圍為:26～30℃。

2.5 培養(yǎng)方式對產(chǎn)毒的影響

由圖6可以看出,全天振蕩培養(yǎng)產(chǎn)毒量與種子萌發(fā)抑制率均達(dá)到最高?？赡苁钦袷幣囵B(yǎng)加速了氣體的交換,提供了充足的氧氣,也加速了培養(yǎng)液中營養(yǎng)的利用,從而增強(qiáng)了菌絲的產(chǎn)毒能力;而靜止培養(yǎng)菌落僅僅漂浮于培養(yǎng)液表面生長,無法獲得充足的氧氣與營養(yǎng),致使產(chǎn)毒的量較低。

2.6 光照對產(chǎn)毒的影響

由圖7可以看出,總的來說光照對產(chǎn)毒的影響不大。光照不但沒有使毒素增加,反而有減少的趨勢,可能光照對產(chǎn)毒有抑制作用,所以本試驗(yàn)采用黑暗培養(yǎng)。

圖7 光照對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的影響

2.7 接菌數(shù)量對產(chǎn)毒的影響

由圖8可以看出,接菌數(shù)量從1碟到5碟產(chǎn)毒量與種子萌發(fā)抑制率逐漸上升,接菌數(shù)量為5碟時(shí)產(chǎn)毒量與種子萌發(fā)抑制率達(dá)到最高;7碟時(shí)有所降低,其可能原因是菌碟數(shù)量太多導(dǎo)致培養(yǎng)液營養(yǎng)供應(yīng)不足。

圖8 接菌數(shù)量對番茄葉霉病菌產(chǎn)毒的影響

3 討論

培養(yǎng)液對病原菌產(chǎn)毒影響很大,Plich's培養(yǎng)液最適于辣椒疫霉(Phy tophthora capsici)的生長和產(chǎn)毒[11]。高洪敏用4種培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮孢菌,以Richard培養(yǎng)基產(chǎn)生毒素的活性最高[12]。番茄葉霉病菌毒素的產(chǎn)生也同樣受到培養(yǎng)液的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明,PS培養(yǎng)液是番茄葉霉病菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)液。

在科研和生產(chǎn)中,都需要盡可能地獲得最多的毒素。培養(yǎng)條件如:培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的pH及培養(yǎng)時(shí)間等是影響毒素產(chǎn)量的重要因素。石曉燕等對禾谷鐮刀菌(F.gram inearum)液體培養(yǎng)產(chǎn)毒條件研究表明,禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒的最適溫度為20℃,pH為5～6,光照可抑制毒素的產(chǎn)生,一般培養(yǎng)21～28 d達(dá)到產(chǎn)毒高峰[13]。劉亞光等[8]得出大豆灰斑病菌(Cerospora sojina)的最適產(chǎn)毒條件為:pH6～7,蔗糖濃度為3%,在25～28℃靜止培養(yǎng)25～27 d。本試驗(yàn)得到的最適培養(yǎng)條件為:pH為6、溫度為26～30℃、培養(yǎng)時(shí)間21 d、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)、接菌數(shù)量5碟。

許多研究[14-17]表明,各種培養(yǎng)條件分別達(dá)到最優(yōu),組合起來即為最優(yōu)培養(yǎng)條件。這為本研究尋找到最優(yōu)產(chǎn)毒條件提供了理論基礎(chǔ)。

趙曉軍等[18]研究表明,同一菌株毒素對胚芽的抑制率大于胚根。因此,在利用毒素測定不同菌株的生物活性時(shí),采用種子萌發(fā)抑制率為宜。所以,本試驗(yàn)沒有對胚根抑制率進(jìn)行測定。

多數(shù)植物病原真菌可以產(chǎn)生毒素,這些毒素在其致病過程中的作用不同。由于有些植物病原菌分泌的毒素在植物上可以引起與活菌相似的癥狀和病理變化,因此可以替代活菌進(jìn)行品種的抗性鑒定。這種方法快速、簡單、定量性好,使繁重的田間抗病性鑒定工作可在室內(nèi)完成[19]。劉慧芹在試驗(yàn)中證實(shí)了中雜8號(hào)與其他品種相比較,對毒素的敏感性最小,與其田間抗病性強(qiáng)一致[3]。這表明可以利用葉霉病菌毒素對番茄進(jìn)行抗病性鑒定。

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