孫 亞 娟， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

虎眼萬年青(Ornithogalum caudatum Ait)是一種極具開發(fā)潛力的中草藥?；⒀廴f年青中所包含的虎眼萬年青皂苷屬于甾體皂苷，甾體皂苷具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，如抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等?；⒀廴f年青皂苷OSW-1，是一種具有極強抗癌活性的?；戠尥檐眨瑢Ψ伟?、乳腺癌有明顯的抗癌活性。體外抗p338淋巴細胞白血病活性結(jié)果表明，OSW-1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍[1]，而且對正常細胞沒有毒性。迄今為止，國內(nèi)對虎眼萬年青的研究，主要集中在多糖的提取及藥理活性[2-4]和組織培養(yǎng)方向[5]，對于虎眼萬年青皂苷的分離提取的報道很少。本實驗室肖沖等[6]已從虎眼萬年青中提取了虎眼萬年青皂苷，由于單體皂苷作用不同，所以有必要制成單體皂苷制劑。本實驗以分離得到虎眼萬年青皂苷單體組分為首要目的，用硅膠柱層析法嘗試分離虎眼萬年青皂苷單體組分。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

虎眼萬年青總皂苷，實驗室自制；硅膠，青島海洋化工廠；薄層層析板(TLC)，德國Merck公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛郎儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 薄層層析(TLC)

本實驗所用薄層層析板由德國Merck公司生產(chǎn)。用微量取樣器取一定量樣品點于薄層層析板起始線上，電吹風吹干，置于放好展開劑的展開缸中展開后，吹干溶劑，10% H2SO4溶液顯色，得TLC圖譜。所用展開劑為：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7.0∶3.0∶0.5。

1.2.2 減壓硅膠柱層析

制備樣品膠：稱取一定量的虎眼萬年青總皂苷放入瓷碗中，加入適量的甲醇，充分溶解后，與1.5倍樣品質(zhì)量的80～100目硅膠混合，攪拌均勻，60 ℃水浴鍋上加熱，待樣品被硅膠吸附，溶劑充分揮發(fā)干燥后，磨成均勻的粉末，樣品膠制備完成。

裝柱：先用一小塊脫脂棉堵住柱底，然后取16倍樣品質(zhì)量的300～400目硅膠(分離膠)裝柱，保持水平，抽真空壓實，然后在其上面裝入薄薄一層80～100目的硅膠，再裝入干燥好的樣品膠，最后在樣品膠上面鋪上一層脫脂棉，抽真空壓實。

硅膠柱裝好后，先用純氯仿通柱子，再用氯仿-甲醇的混合溶劑進行洗脫，每次大約100 mL，分別收集洗脫液。用薄層層析法跟蹤檢測整個洗脫過程，根據(jù)硅膠板上顯示的結(jié)果，把具有相同組分的洗脫液收集在一起，濃縮得固體產(chǎn)物。

本實驗虎眼萬年青總皂苷用量為5 g，洗脫液比例為V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1。

1.2.3 超高壓液相色譜檢測虎眼萬年青皂苷

實驗所用為美國Waters Acquity UPLC色譜儀；C18色譜柱為waters 50 mm×2.1 mm，1.7 μm；進樣量為3 μL。流動相A為乙腈，流動相B為水。流動相比例為：初始，A為10%，B為90%；3 min時，A為60%，B為40%；5.5～7 min時，A為100%，B為0。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷

稱取虎眼萬年青總皂苷5 g，硅膠柱層析方法分離。由圖1可知，分離產(chǎn)物按照極性由小到大順序流出，瓶號25～28，48～56，72～77，86～89，97～122為單點，單獨收集，分別標記為A、B、C、D、E加以區(qū)分。

圖1 虎眼萬年青總皂苷硅膠柱分離成分TLC檢測結(jié)果Fig.1 TLC for Ornithogalum caudaside sample separated by silica gel column chromatograph

將所得各單體皂苷組分單獨收集，濃縮后稱重，并計算得率，對比如表1。

表1 各組分洗脫分離收集表Tab.1 Yield of product

2.2 虎眼萬年青皂苷單體的檢測

UPLC檢測虎眼萬年青總皂苷及分離所得單體。精密稱取各樣品1 mg，分別溶于1 mL乙腈，完全溶解過0.45 μm微孔濾膜，取濾液。其UPLC檢測圖譜如圖2～7所示。

由虎眼萬年青總皂苷的色譜圖可以看出，虎眼萬年青總皂苷中含有很多組分，共有12個峰，其中D、E組分的峰值較高，峰面積也相對較大，含量相對較高，比較各色譜圖，可以看出，本次硅膠柱層析對D、E組分的純化效果較好。各樣品保留時間及峰面積所占比例情況見表2。

圖2 虎眼萬年青總皂苷色圖譜Fig.2 Chromatogram of caudaside

圖3 A組分色譜圖Fig.3 Chromatogram of A sample

圖4 B組分色譜圖Fig.4 Chromatogram of B sample

圖5 C組分色譜圖Fig.5 Chromatogram of C sample

圖6 D組分色譜圖Fig.6 Chromatogram of D sample

圖7 E組分色譜圖Fig.7 Chromatogram of E sample

表2 各組分色譜分析對比Tab.2 Analysis for chromatogram of product

3 結(jié) 論

硅膠柱分離虎眼萬年青皂苷樣品5 g，TLC跟蹤檢測，按照極性由小到大依次得到5種虎眼萬年青皂苷單體。得率分別為2.6%、2.6%、3.6%、5.4%、12.6%。超高壓液相色譜檢測各樣品，虎眼萬年青總皂苷中D、E組分的含量相對較高，本次硅膠柱層析對D、E組分的分離效果相對較好。采用硅膠柱層析的方法可以初步達到分離純化虎眼萬年青總皂苷的目的。本實驗對今后研究虎眼萬年青單體皂苷的分子結(jié)構(gòu)及其藥理活性打下一定的基礎。

[1] MIMAKI Y, KURODA M, KAMEYAMA A, et al. Cholestane glycosides from Ornithogalum saundersiae and their potent cytotoxic activity on various malignant tumor cells[J]. Tennen Yuki Kagohutsu Toronkai Koen Yoshishu, 1996, 38:313-318.

[2] 石磊,李娟,劉志強,等. 虎眼萬年青多糖增強非特異性免疫和體液免疫的作用[J]. 吉林大學學報:醫(yī)學版, 2002, 28(3):232-234.

[3] 石磊,段秀梅,胡夢林,等. 虎眼萬年青多糖對小鼠T細胞及其細胞因子IL-2mRNA表達的影響[J]. 吉林大學學報:醫(yī)學版, 2004, 30(5):678-680.

[4] 石磊,譚巖. 虎眼萬年青多糖對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國免疫學雜志, 2002, 18(11):799-803.

[5] TANG Yuping, YU Biao. The chemical constituents from bulbs of Ornithogalum caudatum[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2001, 10(4): 26-28.

[6] 肖沖,魚紅閃. 虎眼萬年青皂苷的分離提取[J]. 大連輕工業(yè)學院學報, 2006, 25(2):93-95.

(XIAO Chong, YU Hong-shan. Separation and extraction of caudaside[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(2): 93-95.)