啟明，辛國，朱國琪

(1.吉林省吉林中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，吉林 吉林 132012；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

藥理研究

川牛膝醇提物對自發(fā)性高血壓大鼠血壓、心肌ACE活性及心肌細(xì)胞直徑影響的研究

啟明1*，辛國2，朱國琪1

(1.吉林省吉林中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，吉林 吉林 132012；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的：探討川牛膝醇提物對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的降壓作用以及對SHR心肌ACE活性、心肌細(xì)胞直徑的影響。方法：將40只SHR大鼠隨機(jī)分為5組：空白對照組，川牛膝醇提物高、中、低劑量組，依那普利組，每組8只。采用尾動脈測壓法測量給藥前及給藥后2，4，6，8周SHR收縮壓，在給藥8周后，觀測心肌ACE活性、心肌細(xì)胞直徑的變化。結(jié)果：給藥8周后，川牛膝醇提物明顯降低了SHR血壓，其中高劑量組的降壓幅度與依那普利組比較無顯著性差異，但中、低劑量組與依那普利組有顯著性差異。同時川牛膝各組均能降低心肌ACE活性、影響心肌細(xì)胞直徑。結(jié)論：川牛膝醇提物的降壓作用與降低心肌ACE活性、影響心肌細(xì)胞直徑有關(guān)。

川牛膝醇提物；血壓；心肌ACE活性；心肌細(xì)胞直徑

原發(fā)性高血壓是以血壓升高為主要臨床表現(xiàn)伴或不伴有多種心血管危險因素的綜合征，通常簡稱為高血壓。高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素，影響重要臟器，如心、腦、腎的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭，迄今仍是心血管疾病死亡的主要原因之一[1]。中藥治療高血壓病不僅不良反應(yīng)小，價格低廉，且是通過多靶點、多層次等途徑降低血壓。尋求有效的中醫(yī)藥治療途徑，對發(fā)揮中醫(yī)藥的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢有著十分重要的意義。

《素問·至真要大論》云：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，而肝之風(fēng)，本之火，火之本，在肝之氣，正如王泰林《西溪書屋夜話錄》中所云：“內(nèi)風(fēng)多火出，氣有余便是火，余故曰肝氣、肝風(fēng)、肝火，三者同出異名?！比呓詾楦蔚牟C(jī)，其根源在于肝之氣血陰陽失調(diào)，關(guān)鍵在于肝氣疏泄失常。王艷等[2]認(rèn)為，肝失疏泄，氣逆于上，是發(fā)生高血壓病的重要原因。在臨床上牛膝能“引血下行”，故臨證重用川牛膝治療“肝氣上逆型”患者，取得了滿意療效。

陳紅[3]在1996年用WX-6型多部位微循環(huán)顯微儀和維多Fas-94型血流快測儀，對川、懷牛膝水煎液進(jìn)行了小鼠腸系膜微循環(huán)、閼血型大鼠全血黏度、紅細(xì)胞壓積等指標(biāo)的對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在改善微循環(huán)方面，川牛膝作用強(qiáng)于懷牛膝。川、懷牛膝均能降低血漿黏度，懷牛膝高劑量降低全血黏度，川牛膝能增強(qiáng)紅細(xì)胞變形能力[4]?；谏鲜鲅芯砍晒?，本研究旨在通過采用原發(fā)性高血壓動物模型，進(jìn)一步驗證牛膝降血壓的效果及作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

川牛膝CyathulaofficinalisKuan飲片購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，馬來酸依那普利片(依蘇)(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份公司，批號06050102，規(guī)格：10mg/片)。

1.2 實驗動物

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40只，雄性，12周齡，體重(265±20)g，清潔級，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，許可證編號：SCKK(京)2005-0013。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗。

1.3 儀器

大鼠尾壓測定儀(BP-6型，成都泰盟科技有限公司)；紫外分光光度計；全自動脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)(德國徠卡)；顯微鏡(奧林巴斯)。

2 方法

2.1 川牛膝醇提物的制備

川牛膝10kg加8倍量水煎煮3次，時間分別為2，2，1h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度1.12～1.15(24℃)的清膏，加入乙醇使含醇量達(dá)60%，攪拌均勻，靜置24h(4℃)，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.30～1.35(80℃)的稠膏,相當(dāng)于0.1g·g-1生藥。

2.2 依那普利混懸液配制

取依那普利片10mg研為極細(xì)粉末，加蒸餾水36mL充分混勻，配成混懸液，每毫升含藥量0.278mg，分裝加蓋，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組及給藥

分組前先測量SHR的體重和血壓，其體重和基礎(chǔ)血壓無明顯的差異性，故將40只SHR隨機(jī)分為5組，每組8只，每籠4只喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行灌胃給藥，灌服量按體重計算，1mL·(100g)-1。給藥時間為每天上午8時，實驗期間各組均飼以高血壓大鼠專用飼料，并自由飲水。實驗過程中每周測量一次體重，依據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，實驗周期為8周。高劑量組，每日分別按12g·kg-1灌服川牛膝醇提物；中劑量組，每日分別按6g·kg-1灌服川牛膝醇提物；低劑量組，每日分別按3g·kg-1灌服川牛膝醇提物(分別相當(dāng)于人臨床劑量的60,30,15倍)；陽性對照組，每日按0.278mg·mL-1灌服依那普利片(相當(dāng)于人用劑量的16.65倍，與低劑量組倍比相當(dāng)),空白對照組給予相同體積生理鹽水。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 一般觀察 包括進(jìn)食、水量、體重、外觀毛色、活動情況等。

2.4.2 測量血壓值 使用BP-6型測壓儀測量大鼠尾動脈收縮壓，給藥期間兩周測一次血壓，每次測3個值，取平均數(shù)。測量時間均選在上午灌藥后1.5h進(jìn)行。

2.4.3 生化指標(biāo)(心肌ACE活性)及心肌細(xì)胞直徑

2.4.3.1 心肌采集 給藥8周后，于末次給藥后給大鼠禁食12h，稱重，麻醉，腹腔注射戊巴比妥鈉30mg·kg-1麻醉后，迅速打開胸腔摘取心臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分灌洗，取左心室相同部位心肌組織200mg，-70℃保存，以備制備心肌組織勻漿用。取左心室相同部位100mg，用10%中性甲醛液固定，石蠟包埋，2μm切片，以HE染色。

2.4.3.2 心肌ACE活性檢測 一個ACE活性單位為37℃下,每分鐘每毫升組織勻漿液中ACE反應(yīng)產(chǎn)生1nmol馬尿酸。取左心室相同部位心肌組織200mg，用冷生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，在冰浴中剪成碎塊，加組織塊重量9倍的生理鹽水制備10%心肌勻漿，再以3 000r·min-1離心10～15min，取適量上清液，根據(jù)試劑盒操作說明書用化學(xué)比色法檢測ACE活性。原理及簡單步驟是馬尿酸甘氨酰甘氨酸在血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶ACE的作用下水解成馬尿酸及甘氨酰甘氨酸。用醋酸乙酯提取馬尿酸，溶于氯化鈉中，采用紫外分光法(γ=228)測定馬尿酸量，從而間接測定心肌中ACE活性。

2.4.3.3 心肌細(xì)胞直徑的測量 取左心室心肌組織常規(guī)固定、包埋、切片行HE染色。在HE染色下，采用Takemori等描述的方法測量心肌細(xì)胞的直徑[6]每一標(biāo)本隨機(jī)取5個視野，取其均值作為該標(biāo)本的值。

2.5 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 川牛膝醇提物對SHR血壓的影響

3.1.1 治療8周后的各組大鼠血壓情況比較 結(jié)果見表1。治療前，各組大鼠血壓無顯著差異，治療8周后，川牛膝醇提物各劑量組及依那普利組均明顯降低了自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，各治療組與空白對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組治療前及治療后2，4，6，8周血壓情況 /mmHg

注：(1)n=8；(2)與空白對照組比較，*P﹤0.05，**P﹤0.01

3.1.2 治療4、8周后血壓變化幅度比較 結(jié)果見表2。未經(jīng)藥物治療的空白對照組血壓逐漸升高，治療4周時，依那普利組的降壓幅度明顯優(yōu)于川牛膝各組(P<0.01)，治療8周后各組大鼠血壓的降低幅度比較，川牛膝高劑量組與依那普利組無顯著性差異(P>0.05)，中、低劑量組與依那普利組有顯著性差異(P<0.01)。

表2 治療4、8周后血壓降低幅度 /mmHg

注：(1)n=8；(2)與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與依那普利組比較，△△P<0.01

3.2 川牛膝醇提物對SHR心肌ACE活性的影響

結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠心肌ACE活性 單位/(mL·mg組織)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與依那普利組比較，△△P<0.01

3.3 川牛膝醇提物對SHR心肌細(xì)胞直徑的影響

結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞直徑 /L·μm-1

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與依那普利組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論與分析

SHR是一種遺傳高血壓模型，與人類的原發(fā)性高血壓相似?，F(xiàn)代研究[5]，原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜而且不明確，是多因素、多層次共同作用的結(jié)果。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在高血壓病的發(fā)生及發(fā)展中占有極其重要的地位，而該系統(tǒng)中的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能直接收縮血管，升高血壓、調(diào)節(jié)自主神經(jīng)、影響鈣離子內(nèi)流和刺激其他縮血管因子釋放；此外，其長期作用可影響心肌內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管平滑肌細(xì)胞表型，在心室和血管的重構(gòu)中起重要作用[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶是一種二肽羧肽酶，廣泛存在于人體各組織器官中。血管緊張素Ⅰ在轉(zhuǎn)換酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，它有很強(qiáng)的生物活性，除引起小動脈收縮外，還能促使醛固酮的分泌及鈉離子和水分的重吸收，使血容量增加和血壓升高。ACE可使血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，后者是一種強(qiáng)效收縮劑，可刺激腎上腺球狀帶細(xì)胞釋放醛固酮，導(dǎo)致水鈉潴流。另外，ACE還與緩激肽的降解有關(guān)，緩激肽作用于內(nèi)皮β2-激肽受體，刺激NO產(chǎn)生，通過促進(jìn)血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增生、過多細(xì)胞間質(zhì)形成及急慢性血管痙攣等多個環(huán)節(jié)，加速冠狀動脈粥樣硬化進(jìn)程。心肌細(xì)胞是永久細(xì)胞，一般情況下不發(fā)生增殖或者增殖率極低。高血壓左心室肥厚時，由于壓力負(fù)荷增加、血液動力學(xué)改變、局部AngⅡ產(chǎn)生過多等因素作用，刺激某些凋亡基因活化凋亡相關(guān)蛋白的合成，使心肌細(xì)胞凋亡增加。Ravassa等[7]發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ在SHR左心室肥厚中能顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失無法再生，機(jī)體通過一系列的調(diào)節(jié)，刺激成纖維細(xì)胞增殖，通過間質(zhì)纖維化和膠原增加來維持心臟的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致高血壓心臟肥大。依那普利是口服有效的非肽類ACEI，可明顯抑制血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)減弱Ang-Ⅱ介導(dǎo)的一切作用而產(chǎn)生降壓等效果；亦可減少醛固酮的釋放致水鈉潴留減輕；抑制局部組織如腎臟、血管壁及腦內(nèi)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等，從而阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用，導(dǎo)致血壓降低。其主要是通過對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制而實現(xiàn)的，實質(zhì)是通過抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng-Ⅱ而降低血壓，減少繼發(fā)于高血壓病的心、腎等血管病變的發(fā)生[8]。

[1] 陸再英，鐘南山.內(nèi)科學(xué)(第七版)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：251.

[2] 王艷,蓋國忠.引血下行法治療高血壓病[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,24(1)：45.

[3] 陳紅，石圣洪.中藥川、懷牛膝對小鼠微循環(huán)及大鼠血液流變學(xué)的影響[J].中國微循環(huán)，2002，2(3)：182.

[4] 孫水平，李新華，孫曙光.懷牛膝的藥理研究續(xù)報[J].河南中醫(yī)，1985，5(1)：40.

[5] 王先梅，楊麗霞.原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 西南國防醫(yī)藥，2005，15(1)：98.

[6] Takemori E, Hasegawa Y, Kalahira J, et al. Effects of benazapril hydrochloride on cardiac hypertrophy in spontaneously hypertensive rats[J]. Drug Res, 1991, 41: 612-615.

[7] Ravassa S，F(xiàn)ortunoMA， Gonzalez A，et al. Mechanisms of increased susceptibility to angiotensin II-induced apoptosis in ventricular cardiomyocytes of spontaneously hypertensive rats[J]. Hypertension，2000，36(6): 1065-1071.

[8] Dogle JC, Mottram DR, Stubbs H. Prescribing of ACE inhibitors for cardiovascular disorders in general practice[J]. J Clin Pharm Ther, 1998, 23: 133-136.

[9] OVP-維德出版社.維德臨床用藥年鑒[M].香港：中信出版社,德國OVP-維德出版社,1998：240.

ResearchaboutEthanolExtractofCyathulaOfficinalisKuanonSpontaneouslyHypertensiveRat(SHR)′sPressureandtheInfluenceontheActivityofCardiomyocyteACEandTransdiameterofCardiomyocyte(TDM)oftheSHR

Qi Ming1, Xin Guo2, Zhu Guoqi1

(1.JilintraditionalChineseandWesternMedicineCombinationHospitalofJilinProvince,JilinJilin132012,China; 2.ThefirstAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine,ChangchunJilin130021,China)

Objective: To explore the hypotensive effect of ethanol extract of Cyathula officinalis kuan on Spontaneously hypertensive rat(SHR)and the influence on the activity of the cardiomyocyte, and transdiameter of cardiomyocyte(TDM)of the SHR.Methods: randomly divide 40 SHRs in to 5 groups: blank control group, the high, middle, low dose of ethanol extract of Cyathula officinalis kuan and enalapril. Each grou Phas 8 SHRs. Measure the systolic pressure of the SHR of 2,4,6,8 weeks respectively both before and after drug administration with the tail-artery blood pressure measurement. 8 weeks after drug administration, observe the activity of the cardiomyocyte ACE, and the TDM of the SHR.Results: 8 weeks after drug administration, ethanol extract of Cyathula officinalis kuan decreases the blood pressure of the SHRs obviously. The lowering range of the blood between the high dose grou Pand the enalapril grou Pshows no significant difference while the middle and low dose grou Pand enalapril grou Pstill significant difference. Meanwhile, each grou Pof Cyathula officinalis kuan can reduce the activity of the cardiomyocyte, and TDM of the SHR.Conclusion: the hypotensive effect of ethanol extract of Cyathula officinalis kuan is relevant with the reduction of the activity of the cardiomyocyte, and the TDM of the SHR.

Ethanol extract of Cyathula officinalis kuao; Blood pressure; The activity of the cardiomyocyte ACE; TDM

*啟明，Email：qiming629@yahoo.com.cn

2009-12-07)