吳蜀瑤，李敏，王佳黎

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

HPLC測(cè)定青蒿植株不同部位的東莨菪內(nèi)酯含量

吳蜀瑤，李敏*，王佳黎

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定青蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量，并對(duì)青蒿植株不同部位的東莨菪內(nèi)酯的含量進(jìn)行比較。方法：Kromasil ODS-1色譜柱(250mm×4.6mm)，甲醇-水(40∶60)為流動(dòng)相，測(cè)定波長(zhǎng)：344nm，流速：0.8mL·min-1，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：15μL。結(jié)果:東莨菪內(nèi)酯在0.077 5～0.31μg呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9，平均回收率為99.74%，RSD=2.33%。結(jié)論：該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較好，測(cè)定方法可靠，可用于青蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明，青蒿各部位的含量依次為：葉>花>根>子>莖。

青蒿；高效液相色譜法；東莨菪內(nèi)酯

青蒿來源于菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分[1]，其味苦、辛，性寒，具清熱解暑，除蒸，截瘧功能。臨床上用于暑邪發(fā)熱，陰虛發(fā)熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸[2]。除青蒿地上部分外，《本草綱目》青蒿條下亦收載有青蒿根及青蒿子，謂其根“苦、寒、無毒”，“青蒿子甘、冷、無毒。功用和青蒿葉相同。”此外，《江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1989年版)也收載了青蒿子。另外，古代醫(yī)藥方書中有一些單方或復(fù)方使用青蒿根及子治療多種疾病的記載。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，青蒿中的香豆素類成分主要有東莨菪內(nèi)酯、香豆素等。而東莨菪內(nèi)酯具有抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰、平喘等藥理作用，為青蒿的有效成分之一[3，4]。本文以東莨菪內(nèi)酯為指標(biāo)性成分，建立高效液相色譜法測(cè)定青蒿中東莨菪內(nèi)酯的含量，并比較青蒿不同植株部位中該成分含量的差異，不僅對(duì)青蒿藥材和制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為擴(kuò)大黃花蒿的藥用資源提供了參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian高效液相色譜儀；KQ-3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP121S電子天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 試藥

HPLC用甲醇為色譜純，水為純凈水；其余試劑均為分析純。東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)110768-200504)。

青蒿藥材采自四川省安岳縣青蒿基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為菊科植物黃花蒿ArtemisisaannuaL.的干燥全株。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil ODS-1(250mm×4.6mm)；流動(dòng)相：甲醇-水(40∶60)；測(cè)定波長(zhǎng)：344nm；流速：0.8mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：15μL。在該條件下，東莨菪內(nèi)酯色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按東莨菪內(nèi)酯峰計(jì)算為3 000以上。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品15.5mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(0.155mg·mL-1)。臨用前精密量取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.015 5mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 線性范圍的考察

分別吸取上述0.015 5mg·mL-1的對(duì)照品溶液5，10，12.5，15，20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定其峰面積。以東莨菪內(nèi)酯進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=37 649 520.0X+1 202 600.1，r=0.999 9。結(jié)果表明，東莨菪內(nèi)酯在0.077 5～0.31μg呈良好線性關(guān)系，對(duì)照品色譜圖見圖1。

A.東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品 B.葉 C.花 D.莖 E.子 F.根圖1 東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品及青蒿HPLC圖

2.4 供試品溶液制備方法的考察和確定

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)提取過程中影響提取效率的提取方式、提取溶劑、溶劑體積三因素進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以東莨菪內(nèi)酯含量為指標(biāo)，選用青蒿全株進(jìn)行樣品制備，按照L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以超聲60min、甲醇15mL提取為供試品的最佳提取方案，即：取藥材粉末約0.25g(平行2份)，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加入甲醇15mL，稱定重量，超聲處理60min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.015 5mg·mL-1)15μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值，RSD=0.98%，說明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照擬定的方法，取同一樣品，平行6份，制備成供試品溶液，進(jìn)樣15μL，測(cè)得峰面積，并計(jì)算東莨菪內(nèi)酯的含量。平均含量為0.819 8mg·g-1，RSD=1.05%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照擬定的方法制備供試品溶液，室溫密閉保存，分別于0,1,2,4,8,10h進(jìn)樣15μL，計(jì)算樣品中的東莨菪內(nèi)酯峰面積值，RSD=1.62%。試驗(yàn)表明，供試品溶液可在室溫下密閉保存10h，不影響測(cè)定結(jié)果。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一已知含量的青蒿全株樣品粉末9份，每份約0.10g，精密稱定，分別精密加入東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品(0.155mg·mL-1)0.4,0.4,0.4,0.6,0.6,0.6,0.8,0.8,0.8mL，按照已確定的方法制備供試品溶液并依法測(cè)定,結(jié)果見表1。

表1 東莨菪內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，3種水平9次試驗(yàn)的加樣回收率測(cè)得結(jié)果均在95%～105%，說明東莨菪內(nèi)酯的提取和檢測(cè)方法可行。

2.9樣品的含量測(cè)定

取青蒿葉、花、莖、根、子藥材各約0.25g，平行兩份(n=2)，精密稱定，按上述含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。

表2 青蒿子、葉、花、莖、根的含量測(cè)定 /mg·g-1

3 討論

通過紫外分光光度計(jì)對(duì)東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品的甲醇溶液，在200～400nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東莨菪內(nèi)酯在255nm,260nm以及344nm處均有吸收峰，由于在前兩者的波長(zhǎng)下干擾峰較多，分離度較差，而在344nm處?kù)`敏度高，雜質(zhì)干擾小，故選擇344nm為含量測(cè)定的波長(zhǎng)。

在對(duì)供試品溶液提取方法進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，確定了3個(gè)對(duì)提取方法產(chǎn)生主要影響的因素，其中提取方式選用了超聲60min、回流60min、溫浸(45℃，10h)3個(gè)水平，提取溶劑選用甲醇、85%甲醇、95%乙醇3個(gè)水平，提取溶劑的體積選用10，15，20mL 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。另外，由于曾做過超

聲40，60，80min的單因素考察，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在60min時(shí)已基本提取完全，故未將提取時(shí)間再列入因素表進(jìn)行考察。

本實(shí)驗(yàn)建立了青蒿中東莨菪內(nèi)酯的HPLC含量測(cè)定方法，通過方法學(xué)考察表明，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較好，測(cè)定方法可靠。用該方法測(cè)定的結(jié)果為：青蒿葉中東莨菪內(nèi)酯的含量最高，達(dá)1.210 6mg·g-1，而青蒿莖的含量最低，僅為0.082 7mg·g-1，青蒿葉中東莨菪內(nèi)酯含量約為莖中含量的14倍。

[1] 肖培根.新編中藥志(第三卷)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：154.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(精選本)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：1851.

[3] 楊嵐，王滿元，張東，等.青蒿藥材中東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(10)：10-11.

[4] 陳玉敏，曹紅，周蘇萍.高效液相色譜法測(cè)定丁公藤中東莨菪內(nèi)酯的含量[J].中成藥，2005，27(12)：1461-1462.

DeterminationofScopoletineinDifferentPartsofQinghaobyHPLC

Wu Shuyao, Li Min, Wang Jiali

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,ChengduSichuan611137,China)

Objective: To establish HPLC method for the determination of Scopoletine in Qinghao and analyze Scopoletine contents in differdnt parts of Qinghao.Methods: Scopoletine in Qinghao was determined by HPLC with Kromasil ODS-1 column(250mm×4.6mm).The mobile phase was methanol-water(40∶60). The detection wavelength was 344nm. The column temperature was 25℃, the flow rate was 0.8mL·min-1, and the sampling volume was 15μL.Results: The linearity of Scopoletine was good in range of 0.077 5～0.31μg (r=0.999 9). The average recovery was 99.74%, RSD was 2.33%.Conclusion: The method is simple, accurate, repeatable and suitable for the determination of Scopoletine in Qinghao. The results show that the contents of Scopoletine in different parts of Qinghao are: leaf>flowers> roots> fruit> stems.

Artemisia annua; HPLC; Scopoletine

*李敏，E-mail：028limin@163.com

2010-03-24)