蒲楊柳,楊貴樹,李應(yīng)進,宋春蓮,尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.晉寧縣晉城獸醫(yī)站,云南昆明 650605)

豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)是一類由多種疾病因素引起的豬呼吸道疾病,它比普通的呼吸道疾病傳播更廣、病情更重,也更難以防制,發(fā)病率30%～80%,死亡率在5%～30%或以上,造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1-2]。目前PRDC己上升為規(guī)?；i場的主導(dǎo)疾病,在世界范圍內(nèi)廣泛地危害養(yǎng)豬業(yè)。PRDC見于不同生產(chǎn)模式的豬場,包括規(guī)模化養(yǎng)豬場,對各個日齡段和生產(chǎn)階段的豬群,包括母豬、哺乳仔豬、保育豬和育肥豬等產(chǎn)生危害。PRDC是一種多因子疾病,在典型的病例中可以檢出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬肺炎支原體(MH),豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)、豬多殺性巴氏桿菌(Pm)、副豬嗜血桿菌(H p)等常見幾種病原[3]。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的,以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難、高病死率及育肥豬呼吸道癥狀為特征的一種病毒病[4-5]。PRRSV可損害感染豬的免疫系統(tǒng),影響豬對其他疫病免疫抗體的產(chǎn)生,引起其他疫病的免疫失敗,常常造成多種病原的并發(fā)或繼發(fā)感染,加劇病情,使病死率增高,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。我國從1996年首次報道PRRS以來,已有許多省份相繼有該病的報道。本病的流行特點及其病原特性,決定了該病一旦在豬群中出現(xiàn),將很快通過空氣和接觸及人工授精等途徑傳播開來,特別是在規(guī)模化、集約化、現(xiàn)代化的高密度養(yǎng)豬地區(qū),該病傳播尤為迅速,經(jīng)濟損失更為嚴重。本研究采用RT-PCR方法,對2008年秋季和冬季,云南省滇東、滇西、滇北、滇南和滇中32個規(guī)模養(yǎng)殖場無菌采取仔豬、育肥豬、母豬和公豬共552份全血進行了PRRSV檢測,以期能從病原學(xué)上更準確地了解PRRSV在云南省不同地區(qū)豬群中的感染情況,為有效地預(yù)防和控制PRRS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2008年秋季和冬季,在云南省滇東、滇西、滇北、滇南、滇中等地區(qū)共32個規(guī)模養(yǎng)殖場,以無菌方式采取仔豬、育肥豬、母豬和公豬共552份肝素抗凝全血,于4℃保存。

1.1.2 主要試劑 總RNA抽提試劑T rizol購自Invitrogen公司;M-mLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;RNasin購自華美公司;氯仿、異丙醇等試劑均為分析純級別。Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2 000購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考GenBank公布的美洲型VR-2332 PRRS[6]病毒ORF7基因序列和文獻,選擇設(shè)計擴增核衣殼蛋白基因(N)的上下游引物分別為 P1(5′-AAT GGC ACG CCA GTC AAT CA-3′)和 P2(5′-TCA TGC TAA GGG TGA TGC TG-3′)。預(yù)期擴增 PRRSV目的基因片段為304 bp,引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA的提取 參照文獻[7]進行。根據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司的血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取病毒總RNA,提取的RNA樣品保存在-20℃或-70℃。

1.2.3 病毒cDNA的合成 根據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司的BioTeke super RT Kit試劑盒說明進行病毒cDNA的合成。

1.2.4 目的基因片段的擴增 PCR反應(yīng)體系:10×PCR buffer(含 MgC12)5.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL,上、下游引物 P1(10 pm ol/μL)和 P2(10 pm ol/μL)各 1.0 μL,cDNA 4.0 μL,0.5 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL),加dH 2O至50μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃3min;95℃1min,57℃1 min,72℃1.5 min,共35個循環(huán);72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5μL PCR產(chǎn)物在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察。

2 結(jié)果

2.1 血液樣品RT-PCR產(chǎn)物的電泳

擴增的基因片段長度在DNA M aker DL 2 000 250 bp與500 bp之間,與預(yù)期的304 bp相符,提示擴增產(chǎn)物可能為預(yù)期目的條帶。將此片段進行序列測定,測序結(jié)果表明為正確擴增(圖1)。

圖 1 PRRSV目的基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 The result of PRRSV amplified by PCR

2.2 PRRSV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

用擴增PRRSV ORF7基因片段的引物,對所采血樣進行了PRRSV感染的狀況調(diào)查,結(jié)果見表1和表2,從中可以看出,所有受檢地區(qū)樣品中均存在PRRSV感染,平均總陽性率為70.1%(387/552)。在不同生長階段豬群中,以仔豬帶毒的陽性率最高,為78.5%(113/144)。在不同區(qū)域豬群中,最高為滇東(73.0%),其次為滇南(72.7%),滇中(72.2%),滇西(67.2%),滇北(65.6%)。秋季比冬季的平均感染率相對偏低,秋季、冬季的平均陽性率分別為64.86%和75.36%。

表1 云南省不同地區(qū)豬場秋季PRRSV的PCR檢測結(jié)果Table1 The resu lts of PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in autumn

表2 云南省不同地區(qū)豬場冬季PRRSV的PCR檢測結(jié)果Table2 The resultsof PRRSV amplified by PCR in pig farms in different regions in w inter

3 討論

近年來,尤其是2006年中期后,PRRS以傳播迅速和高發(fā)病率、高病死率的流行病學(xué)特征在我國廣泛流行。本調(diào)查從云南省32個規(guī)模化豬場采集豬血液樣本進行了PRRSV RT-PCR檢測,采樣范圍基本含蓋了全省,且本次調(diào)查針對不同年齡豬,其所得結(jié)果更具有普遍性和代表性。

從不同生產(chǎn)用途分析,公豬PRRSV感染陽性率為76.7%(46/60),母豬 73.4%(102/139),育肥豬60.2%(126/209)。相對而言,公豬陽性率較母豬和育肥豬高。這可能是由于公豬一般不接種PRRS疫苗,PRRSV可以通過精液間斷性排出,而沒有臨床癥狀或處于亞臨床癥狀[8],公豬的PRRSV感染往往成為豬場疫病防制中容易忽視的環(huán)節(jié)。因此有必要加強公豬的免疫監(jiān)測與凈化工作,特別注意種公豬的對外引進。此外,對本次PRRSV檢測結(jié)果為陽性的部分豬場進行跟蹤調(diào)查,發(fā)現(xiàn)檢出陽性病料的豬場中多數(shù)母豬有繁殖障礙情況,表明PRRSV感染已成為豬場中母豬發(fā)生繁殖障礙的主要原因。

斯特勞等[9]報道,各種品種、不同年齡和用途的豬均可感染,但以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感。本次調(diào)查也得到了相似的結(jié)果,在不同生長階段豬群中,仔豬陽性率為78.5%(113/144),母豬73.4%(102/139),較育肥豬60.3%(126/209)陽性率相對要高。

不同季節(jié)感染狀況調(diào)查結(jié)果表明,云南省冬季豬群PRRSV感染率相對秋季高。秋季、冬季的PRRSV感染平均陽性率分別為64.86%、75.36%。這可能和云南獨特的氣候有關(guān)。云南氣候?qū)賮啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候類型,冬暖夏涼,是各種病毒孳生的溫床。

不同區(qū)域PRRSV感染調(diào)查調(diào)查結(jié)果表明,云南不同地區(qū)PRRS流行情況有一定差異性,其中,滇東最高為73%,其次滇南為72.7%,滇中為72.2%,滇西為67.2%,滇北為65.6%,這表明滇東地區(qū)是云南省PRRS的高發(fā)地區(qū)。這種差異可能與云南地理環(huán)境有關(guān)。云南氣候垂直變化十分明顯,而滇東大部分地區(qū)屬于亞熱帶和溫帶地區(qū),這樣適宜的氣候有利于PRRSV的生存。且東部交通運輸便利,人流物流較頻繁,很容易形成病毒流通網(wǎng)。

近年來RT-PCR已廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷。RT-PCR方法一般用于PRRSV組織病料(肺臟)的檢測,本試驗初步建立了從含毒量較少的血液和精液檢測PRRSV的RT-PCR方法,為更有效、經(jīng)濟、快捷的檢測PRRSV提供了參考。

[1]白芳華,劉健鵬,等.豬呼吸道疾病綜合征的防治措施[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(3):103-1043.

[2]Woeste K,Grosse Beilage E.T ransm ission of agentsof theporcine respiratory disease com plex betw een sw ine herds:a review.Part 1——diagnosis,transm ission by animal contact[J].2007,114(9):324-6,328-337.

[3]衛(wèi)秀余,宋文秀,余紅梅,等.48個發(fā)生PRDC豬群中病原體的檢測結(jié)果[J].現(xiàn)代化養(yǎng)豬,2004(6):12-13.

[4]殷 震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[5]Cho J G,Dee S A.Porcine rep rodu ctive and respiratory syndrome virus[J].Theriogenology,2006,66(3):655-662.

[6]Nielsen H S,Liu G,O leksiew icz M B,et al.Generation of an infectious clone of VR-2332,a highly virulent No rth Americantype isolate of porcine rep roductive and respiratory syndrome virus[EB/OL].h ttp://cat.inist.fr/?aModele =afficheN&cpsidt=14613075.

[7]薩姆布魯克 J,拉塞爾 D W.分子克隆實驗指南[M].黃培堂,等,譯.3版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[8]吳旭穎,趙 偉,王穎豬.繁殖與呼吸綜合征的癥狀表現(xiàn)及研究進展[J].中國豬業(yè),2008(7):30-32.

[9]斯特勞,阿萊爾,蒙加林,等.豬病學(xué)[M].趙德明,等,譯.8版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2000:205-238.