張少華,任麗琴,包永占,秦建華,史萬玉,鐘秀會

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河北保定 071001)

中藥透皮劑是一種集傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代藥劑技術(shù)相結(jié)合的新型中藥制劑。本試驗通過體外透皮試驗,以中藥軟膏劑中綠原酸成分為標(biāo)記物,應(yīng)用高效液相色譜法(high-perform ance liquid chromatography,HPLC)測定透過液中綠原酸的含量,評價不同的中藥劑型和不同的透皮促滲劑對中藥軟膏劑透皮效果的影響,并建立中藥軟膏劑中綠原酸透過皮膚的動力學(xué)曲線,評價中藥軟膏劑的透皮效果,旨在為臨床提供安全有效藥物奠定試驗基礎(chǔ)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 金銀花、當(dāng)歸、蒲公英、紅花、冰片等購于安國市祁州中藥廠;硬脂酸甘油酯、凡士林、液體石蠟、氮酮等購于保定華新試劑儀器有限公司。

1.1.2 主要儀器 Agilent 1200液相色譜儀,美國惠普公司生產(chǎn);TT-6(B)透皮吸收試驗儀,天津市正通科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 中藥軟膏劑的制備

1.2.1.1 中藥配方 當(dāng)歸,益母草,忍冬藤,蒲公英,苦地丁 ,瓜蔞 ,紅花,青翹,枳殼 ,牛蒡子 ,黃芩 ,川芎,青皮,木通,王不留行 ,丹參 ,冰片,蟾酥 ,通草 ,萹蓄,地榆,按比例組成復(fù)方。

1.2.1.2 中藥的制備 中藥超微粉:為將單味中藥各自經(jīng)超微粉粉碎機(jī)粉碎后按照配方混合而成;中藥超微粉煎劑:為將上述混合好的中藥超微粉加水煎成1∶1的煎劑即可;普通煎劑:為將中藥粗粉加水煎成1∶1的煎劑即可[2]。

1.2.1.3 基質(zhì)的制備 取硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林及液體石蠟加熱溶化為油相。另將甘油及蒸餾水加熱至90℃,再加入三乙醇胺和山梨酸鉀溶解為水相。然后將水相緩緩倒入油相中,邊加入邊攪拌直至冷凝[3]。

1.2.1.4 透皮促滲劑的加入 將中藥和不同的促滲劑加入到基質(zhì)當(dāng)中,分別制成含 90 g/L冰片、45 g/L冰片+45mL/L氮酮、90 mL/L氮酮3種中藥軟膏劑。

1.2.2 中藥軟膏劑的穩(wěn)定性試驗

1.2.2.1 離心試驗 取中藥軟膏劑10 g放入帶刻度離心管中,3 000 r/min離心30 min,觀察有無分層及破乳現(xiàn)象。

1.2.2.2 耐寒耐熱試驗 將中藥軟膏劑置于具塞試管內(nèi),分別置 55℃恒溫箱 6 h和-15℃冰箱24 h,觀察有無分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象[4]。

1.2.2.3 加速試驗 將中藥軟膏劑裝入具塞試管內(nèi),置于溫度為40℃±2℃、相對濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中,連續(xù)放置3個月定期考察,觀察有無分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象[5]。

1.2.3 中藥軟膏劑的體外透皮試驗

1.2.3.1 皮膚處理 剝離已脫毛24 h小鼠的腹部皮膚,去凈皮下脂肪,用生理鹽水洗凈浸泡,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 透皮試驗 將處理好的皮膚平展于Franz擴(kuò)散池裝置中,固定,給藥室給予2 g透皮用軟膏劑,接收液為生理鹽水6mL,磁力攪拌器攪拌,整個裝置放于39℃恒溫水浴中,藥物從給藥室滲透到接收池,取適量接受液作為樣品,所取樣品以上述色譜條件進(jìn)樣20μL,測定綠原酸的含量[6]。

1.2.3.3 不同取樣點的累計經(jīng)皮滲透量 M按下式計算:

式中,M為累計透皮滲透量;Cn為各取樣點時取樣液的濃度;V為接收池體積;Ci為各取樣點取樣液的濃度;Vi為取樣體積[7]。

1.2.4 HPLC的測定方法

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm ×5.0 μm);流 動 相:乙 腈-水-磷 酸(10∶90∶0.05);流速為:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;檢測波長327 nm。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5mg,精密稱定,加500 mL/L甲醇溶解,配成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液 50 mL。分別精密量取0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 mL于 50 mL 量瓶中,用甲醇定容,搖勻 ,每次進(jìn)樣20μL,以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(A)與藥物濃度(C)進(jìn)行線性回歸得回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.2.4.3 樣品的測定 取樣品按樣品溶液制備操作,分別吸取對照品溶液與樣品溶液各20μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測定,記錄色譜,計算結(jié)果。

1.2.4.4 精密度試驗 精確吸取適當(dāng)濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,計算綠原酸的峰面積和RSD。

1.2.5 不同中藥劑型對中藥透皮劑中藥物含量的影響

1.2.5.1 供試品溶液的制備 取本品約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入500 mL/L甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲提取30min,放冷后,以甲醇補足損失的重量,搖勻,濾過。取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得[9]。

1.2.5.2 樣品的測定 取樣品按樣品溶液制備操作,分別吸取對照品溶液與樣品溶液各20μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測定,記錄色譜,計算結(jié)果。

1.2.5.3 重復(fù)性試驗 按照含量測定方法,對同一樣品制備供試液,平行做5份,測得峰面積并計算RSD。

1.2.6 不同中藥透皮促滲劑對透皮效果的影響

1.2.6.1 供試液的制備 將上述試驗篩選出的最佳中藥劑型制備成3種含不同促滲劑的中藥透皮劑,各取2 g加在給藥室中;接受池內(nèi)加6mL生理鹽水,使皮膚與接受液面接觸,在39℃±0.1℃條件下,連續(xù)攪拌,10 h后各取樣2 mL,用于綠原酸透皮量的測定[10]。

1.2.6.2 樣品的測定 樣品用0.45μm微孔濾膜過濾后,取20μL進(jìn)行HPLC測定,重復(fù)測定3次,測得峰面積并計算含量。

1.2.6.3 重復(fù)性試驗 同1.2.5.3。

1.2.7 中藥軟膏劑透過皮膚的動力學(xué)曲線

1.2.7.1 供試液的制備 將上述試驗篩選出的最佳中藥劑型和最佳透皮促滲劑制備成最佳中藥透皮劑,取2 g加入到給藥室中;接受池內(nèi)加6mL生理鹽水,使鼠皮與接受液面接觸,在39℃±0.1℃條件下,連續(xù)攪拌,分別于加樣后連續(xù) 7 h各取樣2mL,用于綠原酸透皮量的測定[11]。每次取樣后補加生理鹽水2 mL。

1.2.7.2 樣品的測定 樣品用0.45μm微孔濾膜過濾后,取20μL進(jìn)行HPLC測定,重復(fù)測定3次,測得峰面積并計算含量。

1.2.7.3 重復(fù)性試驗 同1.2.5.3。

2 結(jié)果

2.1 中藥乳膏劑的質(zhì)量鑒定結(jié)果

中藥乳膏劑的穩(wěn)定性試驗結(jié)果離心試驗、耐寒耐熱試驗與加速試驗中均未見乳膏出現(xiàn)分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現(xiàn)象。乳膏劑應(yīng)色澤均勻,質(zhì)地細(xì)膩,有適當(dāng)?shù)酿こ硇?易于涂布皮膚,無粗糙感,具有一定的相對穩(wěn)定性。通過耐寒耐熱試驗、離心試驗和加速試驗發(fā)現(xiàn):中藥乳膏具有良好的穩(wěn)定性,各項穩(wěn)定性結(jié)果均符合要求。對于有效期要求兩年的產(chǎn)品,在溫度37℃～40℃,相對濕度75%以上的條件下保存3個月,產(chǎn)品穩(wěn)定,則可暫定為有效期2年。所以該中藥乳膏的保質(zhì)期暫可定為2年。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度溶液。按照上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),綠原酸含量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,得回歸方程:y=64.944x-5.359 6(R2=0.999 2),表明在0.05μg/mL～12.8μg/mL范圍內(nèi)線性良好(圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard cu rve

2.2.2 精密度試驗 精確吸取0.2μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,計算綠原酸的峰面積RSD為0.98%,表明進(jìn)樣的準(zhǔn)確性及儀器精密度良好。

2.3 不同中藥劑型對中藥透皮劑中藥物含量的影響

試驗結(jié)果表明,中藥超微粉直接入藥的中藥透皮劑中綠原酸的含量為174μg/g,超微粉煎劑入藥的中藥透皮劑中綠原酸的含量為88μg/g,普通煎劑入藥的中藥透皮劑中綠原酸的含量為62.1μg/g,說明中藥超微粉直接入藥效果最佳(圖2)。

圖2 不同中藥劑型中藥透皮劑綠原酸的HPLC圖譜Fig.2 The chlorogenic acid H PLC patterns in different transdermalagentsof Chinesemedicine formulations

2.4 不同中藥透皮促滲劑對透皮效果的影響

試驗結(jié)果表明,含90 g/L冰片為透皮劑的軟膏劑其10 h綠原酸透過量為5.94μg,含45 g/L冰片+45 mL/L氮酮為透皮劑的軟膏劑其10 h綠原酸透過量為6.6μg,含90 mL/L氮酮為透皮劑的軟膏劑其綠原酸透過量為 4.02μg,說明45 g/L冰片+45 mL/L氮酮作為透皮劑效果最佳(圖3)。

2.5 最佳中藥透皮劑透過皮膚的動力學(xué)曲線

綠原酸累計透過量隨時間延長而不斷增加,累計7 h總透過量為2.726μg(表1)。1 h～4 h綠原酸的經(jīng)皮透過速率不斷升高,5h后透皮速率恒定,呈現(xiàn)近似零級動力學(xué)特征(圖4)。表明該透皮劑具有一定的體外透皮效果,能保持一定的給藥速率。

圖3 不同軟膏劑中藥透皮劑綠原酸的HPLC圖譜Fig.3 The chlorogenic acid HPLC patterns in different transdermaloin tment medicine

表1 綠原酸累積透過量Table1 The penetrated amount of chlo rogenic acid across the skin

圖4 綠原酸透過皮膚的動力學(xué)曲線Fig.4 The perm eation kinetic profile of chlorogenic acid across the skin

3 討論

3.1 中藥乳膏劑透皮試驗研究

中藥乳膏劑為中藥復(fù)方制劑,成分復(fù)雜,很難測定所有成分的透皮量,一般以復(fù)方制劑中某種有效成分的透皮量作為評價指標(biāo),研究復(fù)方制劑的透皮效果。復(fù)方中以金銀花為主藥,其主要成分是綠原酸,所以通過測定中藥乳膏劑中綠原酸的體外透皮量,來驗證透皮劑的不同中藥劑型和不同促滲劑對中藥軟膏劑透皮效果的影響是具有代表意義的[12]。

藥物透皮試驗方法分為體外透皮試驗和體內(nèi)透皮試驗,中藥透皮劑由于成分復(fù)雜,含量低,很難進(jìn)行體內(nèi)透皮試驗的研究。因此該試驗采用體外透皮試驗方法進(jìn)行研究。常用經(jīng)皮膚滲透研究的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等,不同動物皮膚滲透性大小不一,根據(jù)奶牛乳腺皮膚的特點,采用滲透性適中的小鼠皮膚作為體外透皮試驗的皮膚模型[13]。

3.2 中藥超微粉軟膏劑的優(yōu)點

超微粉碎技術(shù)應(yīng)用到中藥制劑中同樣顯示出獨特的優(yōu)勢,研究結(jié)果表明,采用超微粉碎技術(shù)得到的中藥制劑與用傳統(tǒng)工藝得到的中藥制劑相比,增加藥物吸收率,提高生物利用度,有利于保存生物活性成分,提高藥效,節(jié)省資源,降低生產(chǎn)成本,可明顯提高藥效和產(chǎn)品質(zhì)量。中藥大部分是復(fù)方,復(fù)方由各藥材組成,細(xì)胞破壁后,細(xì)胞內(nèi)的水分及油分遷出,使微粒子表面呈現(xiàn)半濕潤狀態(tài),粒子與粒子之間會形成穩(wěn)定的粒子團(tuán)(或稱這為微顆粒),每一個粒子團(tuán)都包含相同比例的中藥成分[14]。該粒子團(tuán)的物理結(jié)構(gòu)隨組分的HLB值(親水、親油平衡值)、延展性、破碎性、含水(油)率、相對密度等不同組合和不同的相互作用而不同。這種結(jié)構(gòu)會使中藥材各有效成分均勻化,使各種成分均勻地被吸收,這也可以增強藥物的作用效果[15]。

3.3 透皮促滲劑的篩選

通常透皮吸收促進(jìn)劑單獨使用的效果不太理想,聯(lián)合使用兩種以上滲透促進(jìn)劑可發(fā)揮協(xié)同促滲作用,從而減少促滲劑的用量,降低毒性反應(yīng),又可使主藥發(fā)揮最佳效能,氮酮、冰片是常見的滲透促進(jìn)劑[16]。因此,我們對這兩種滲透促進(jìn)劑的滲透促進(jìn)效果進(jìn)行了考察,從本試驗可見,冰片與氮酮混合使用,滲透促進(jìn)效果最佳,說明冰片和氮酮在透皮過程中起協(xié)同作用。冰片單獨使用和氮酮單獨使用,二者透皮效果均不佳,但冰片強于氮酮作用,說明在促滲過程中冰片起主導(dǎo)作用,氮酮能起到輔助滲透作用。中藥復(fù)方成分復(fù)雜,冰片偏脂溶性而氮酮偏水溶性,二者合用有利于有效成分的整體吸收[17]。

3.4 中藥透皮劑透過皮膚的動力學(xué)特征

試驗結(jié)果表明,軟膏劑中的中藥有效成分能有效地透過皮膚,這可以較準(zhǔn)確地反映藥物在實際應(yīng)用時的透皮吸收過程,為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。本試驗所得的動力學(xué)曲線類似零級動力學(xué),說明涂膜劑具有維持恒定的血藥濃度或藥理效應(yīng),延長作用時間等優(yōu)點[18]。這些結(jié)果與其他關(guān)于中藥成分體外透皮研究結(jié)果相類似。

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