帥學(xué)宏,蘇子杰,胡庭俊*,曾 蕓,韋英益,李躍華

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

山豆根又名廣豆根,小黃連,為豆科植物柔枝槐(Sophora subprostrata)的根,主產(chǎn)廣西,性寒,味苦,具有清火解毒,消腫止痛等功效[1]。山豆根多糖(Sophora subprostrata polysaccharide,SSP)是從其根部提取出來的一種天然多糖。它不僅可刺激淋巴細(xì)胞增殖,促進(jìn)PWM誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生,刺激小鼠淋巴細(xì)胞分泌IgG[2],且具有抗氧化作用[3]。山豆根多糖還可以增加小鼠脾臟 T淋巴細(xì)胞分泌NO和IL-2,升高Ca2+濃度和增強(qiáng) PKC活性[4]。研究表明,淋巴細(xì)胞表面存在多糖受體,多糖通過與受體結(jié)合,可啟動淋巴細(xì)胞信息傳遞,進(jìn)而影響淋巴細(xì)胞基因表達(dá)和活化增殖[5]。本試驗(yàn)觀察了山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、6-酮-前列腺素 F1α(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)和一氧化氮(NO)信號分子的影響,為進(jìn)一步揭示山豆根多糖的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 良風(fēng)花雞,雄性,健康,60日齡。

1.1.2 藥物與試劑 山豆根多糖,為灰白色粉末、易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑,由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫藥理實(shí)驗(yàn)室分離提取。臨用時滅菌后用完全1640配成溶液;6-keto-PGF1α和 TXB2試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;cAMP和cGMP試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室;無水對氨基苯磺酸為天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;二鹽酸-1-萘乙二胺為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 UV-1800紫外可見光分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);梅特勒-托利多AB104-L電子天平(瑞士);GC-2016型γ放射免疫計數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及分組 將供試雞經(jīng)頸靜脈放血處死,無菌條件下采其脾臟,用D-Hank's洗去表面血液。在培養(yǎng)皿中加入適量的D-Hank's液,將脾臟在其中剪成小塊,輕輕磨碎后用200目濾網(wǎng)過濾,收集濾液,緩慢加在等體積的雞淋巴細(xì)胞分離液中,2 000 r/min離心10 min,收集中間層的淋巴細(xì)胞,用D-Hank's液洗滌兩次后加入無酚紅的RPMI-1640完全培養(yǎng)液,調(diào)整濃度為4×106cells/mL。取4個24孔培養(yǎng)板,分為4個時間段即 4、8、12、24 h,每個時間段分為5組,即空白對照組、4種濃度的山豆根多糖組。每組4個孔,每孔加1 mL淋巴細(xì)胞懸液,然后加入多糖使終濃度達(dá)到 50、100、200、400 μ g/mL。將培養(yǎng)板置入41℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、8、12、24 h,分時段離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清,上清用于測定NO、6-keto-PGF1α和TXB2濃度。細(xì)胞經(jīng)裂解后用于測定 cAMP和cGMP濃度。

1.2.2 測定方法 嚴(yán)格按照試劑盒說明書用放射免疫法測定 cAMP、cGMP、6-keto-PGF1α和 TXB2。參照龐戰(zhàn)軍Griess試劑法[6]略有改進(jìn),測培養(yǎng)液中NO 含量 ,以 NaNO2為標(biāo)準(zhǔn) ,取 0、5、10、25、50、100、160、200、250 μ mol/L 幾個濃度按表 1作標(biāo)準(zhǔn)曲線,單位mL(表1)。

表1 NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1 The preparation of NO2-standard curve

吸取樣品液1 mL,加入等體積Griess試劑,室溫反應(yīng)10 min,550 nm比色測OD值。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 cAMP測定結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出,山豆根多糖在24 h內(nèi)對體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生cAMP有顯著的影響,100 μ g/mL SSP在4 h時能顯著升高 cAMP的濃度(P＜0.05),8 h時cAMP含量達(dá)到最高值,與對照組比差異極顯著(P＜0.01),之后隨著時間的延長,cAMP的含量逐漸減少。其他濃度的SSP對cAMP的含量也有不同程度的影響,總體呈先上升后下降的趨勢(表2)。

表2 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞中cAMP的影響Table 2 Effect of SSP on cAMP in chicken splenic lymphocyte pmol/10 mL

2.2 cGMP測定結(jié)果

從表3結(jié)果可以看出,不同濃度的山豆根多糖作用于體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞,除了4 h時間段400 μ g/mL的 SSP對 cGMP有所降低外 (P ＜0.05),其他組SSP對雞脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 cGMP無顯著的影響。

2.3 山豆根多糖對cAMP/cGMP的影響

山豆根多糖對cAMP/cGMP影響比較明顯,SSP 以 100 μ g/mL 或 400 μ g/mL 濃度與淋巴細(xì)胞培養(yǎng)4 h和8 h時,細(xì)胞內(nèi)cAMP/cGMP比值極顯著升高(P ＜0.01),以后呈下降趨勢,24 h時雖然50 μ g/mL多糖組的比值低于對照組,但其他組基本到達(dá)正常值,各濃度多糖組對cAMP/cGMP比值隨時間延長總體呈先升高后降低的趨勢(表4)。

2.4 6-keto-PGF1α測定結(jié)果

培養(yǎng)4 h時100 μ g/mL的SSP可明顯升高6-keto-PGF1α濃度 (P ＜0.05),至 8 h 時 100、200、400 μ g/mL山豆根多糖均能顯著升高 6-keto-PGF1α的濃度(P ＜0.05),到12 h時除400 μ g/mL的SSP組6-keto-PGF1α濃度有所升高外,其他濃度組都開始下降,24 h時各組均接近正常值(表5)。

表3 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞中cGMP的影響Table 3 Effect of SSP on cGMP in chicken splenic lymphocyte pmol/10 mL

表4 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞中cAMP/cGMP比值的影響Table 4 Effect of SSP on cAMP/cGM P in chicken splenic lymphocy te

表5 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌6-keto-PGF1α的影響T able 5 Effect of SSP on 6-keto-PGF1αsecretion of chicken splenic lymphocytes pg/mL

2.5 TXB2測定結(jié)果

山豆根多糖對培養(yǎng)液中TXB2濃度有升高作用,SSP濃度為100 μ g/mL,在 4 h時能顯著升高 TXB2濃度(P＜0.05),8 h時極顯著升高 TXB2濃度(P＜0.01),從12 h開始下降,到24 h與對照組無顯著差異(表6)。

表6 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌TXB2的影響T able 6 Effect of SSP on T XB2secretion of chicken splenic ly mphocytes pg/mL

2.6 山豆根多糖對6-keto-PGF1α/TXB2的影響

4種濃度的山豆根多糖均可升高6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P ＜0.05)。與對照組比較,培養(yǎng)8 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL 、400 μ g/mL 能分別顯著、極顯著升高 6-keto-PGF1α/TXB2的比值 (P ＜0.05、P＜0.01)。與對照組比較,培養(yǎng)12 h時,4種濃度的山豆根多糖均可顯著升高 6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P ＜0.05)(表7)。

表7 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞6-keto-PGF1α/TXB2影響Table 7 Effect of SSP on PGF1α/TXB2in chicken splenic lymphocytes

2.7 NO測定結(jié)果

一氧化氮濃度=(測定管 OD550-0.073)/0.004 6。相關(guān)系數(shù)r=0.995,NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。結(jié)果顯示,4種濃度的山豆根多糖對NO的濃度均有升高作用。與對照組比較,培養(yǎng)4 h,山豆根多糖濃度為 200 μ g/mL,能顯著升高 NO的濃度(P ＜0.05);培養(yǎng) 8 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL、100 μ g/mL,分別能顯著升高 NO的濃度 (P ＜0.05);培養(yǎng) 12 h,山豆根多糖濃度為 50 μ g/mL、400 μ g/mL,分別能極顯著升高NO的濃度(P ＜0.05);培養(yǎng) 24 h,山豆根多糖濃度為 100 μ g/mL、200 μ g/mL,分別能顯著升高 NO的濃度(P ＜0.05)(表8)。

圖1 NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 NO2-standard curve

表8 山豆根多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的影響Table 8 Effect of SSP on NO production in chicken splenic lymphocytes

3 討論

細(xì)胞內(nèi)主要有以 cAMP、cGMP、DG、IP3和Ca2+為第二信使的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,各個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)彼此聯(lián)系構(gòu)成信號網(wǎng)絡(luò)[7]。在真核細(xì)胞中,cAMP和cGMP是重要的第2信使物質(zhì),分別由腺苷酸環(huán)化酶和鳥苷酸環(huán)化酶合成[8]。當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶活化時,細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生cAMP信號,通過蛋白激酶使蛋白質(zhì)磷酸化來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)。cGMP與cAMP一樣廣泛存在于動物和微生物中,具有細(xì)胞內(nèi)第2信使的功能。cGMP產(chǎn)生信號傳遞機(jī)制與cAMP相似[9]?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,cAMP與 cGMP相互頡頏,密切配合,共同完成生理調(diào)節(jié)功能。一般認(rèn)為 cAMP能抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化,而cGMP可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂,cAMP與cGMP比值在一定程度上反映機(jī)體免疫功能、細(xì)胞增殖和能量代謝等方面的狀態(tài),當(dāng)該比值增大時,表明機(jī)體免疫功能增強(qiáng),反之則表示機(jī)體免疫功能下降[10]。有研究表明[11],雞接種IBD弱毒疫苗提高機(jī)體免疫力時,可以提高細(xì)胞內(nèi)和血漿中信息分子環(huán)核苷酸水平,抗IBDV引起cAMP水平和cAMP/cGMP比值低下。石放雄等[12]研究一種從植物中提取制成的純天然多糖復(fù)合體產(chǎn)品時發(fā)現(xiàn)其能顯著升高雞血漿和肝臟中cAMP、cGMP以及其比值。本試驗(yàn)表明山豆根多糖能明顯升高雞脾臟細(xì)胞中cAMP的水平以及cAMP/cGMP的值,提示山豆根多糖能夠通過cAMP/cGMP途徑增強(qiáng)機(jī)體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

做為一種新發(fā)現(xiàn)的第2信使,花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物越來越受到人們的關(guān)注?；ㄉ南┧崞浯x產(chǎn)物前列腺素、血栓素等的活性不僅可在細(xì)胞外作為第一信使產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng),還在細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞中有重要意義?；ㄉ南┧峒捌浯x產(chǎn)物具有促進(jìn)或放大一些胞內(nèi)信使系統(tǒng)的作用[13]?；ㄉ南┧岽x產(chǎn)物TXA2和PGI2是血栓素類和前列腺類物質(zhì)較為重要的成分,發(fā)揮著主要的生理功能,但TXA2和PGI2在動物體內(nèi)性質(zhì)不穩(wěn)定,易生成性質(zhì)穩(wěn)定的6-keto-PGF1α和 TXB2。因而,多通過測定 6-keto-PGF1α和 TXB2的變化來反映 TXA2和 PGI2的變化情況。6-keto-PGF1α-TXB2是一對平衡體系,6-keto-PGF1α/TXB2比值是衡量該體系是否處于穩(wěn)態(tài)的標(biāo)志之一。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),山豆根多糖能升高雞脾臟淋巴細(xì)胞6-keto-PGF1α和 TXB2水平,當(dāng)培養(yǎng) 12 h時6-keto-PGF1α/TXB2比值升高顯著,說明該多糖能促進(jìn)和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞內(nèi)磷脂、甘油三酯及膽固醇的水解作用并對所釋放的花生四烯酸代謝具有重要調(diào)節(jié)作用,從而調(diào)控免疫細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸信號分子的水平及相關(guān)基因的表達(dá)。這與胡庭俊等[14]研究蕨麻多糖的結(jié)果基本一致。

NO由細(xì)胞內(nèi)NO合成酶催化精氨酸經(jīng)氧化脫氨生成,具有廣泛生物活性。NO在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[15]。據(jù)報道蘆薈多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO生成[16],黃芪多糖也能促進(jìn)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO[17]。有研究認(rèn)為NO可活化鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP起到第2信使的作用[18]。胡庭俊等報道黃芪多糖是通過NO介導(dǎo)信號傳遞通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的濃度,升高脾淋巴細(xì)胞蛋白激酶活性而影響機(jī)體免疫細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的[19]。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)山豆根多糖能促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞NO的生成。由于NO與免疫應(yīng)答及炎癥有關(guān),在免疫系統(tǒng)中作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要介質(zhì)而起作用,故NO可能與cGMP構(gòu)成一條信號傳導(dǎo)通路,本結(jié)果提示山豆根多糖可能通過影響NO-cGMP信號通路而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

[1]徐國鈞.中藥彩色圖譜[M].2版.福建福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社,1997:20-21.

[2]趙武述,張玉琴,任麗娟,等.山豆根多糖刺激抗體產(chǎn)生的作用[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報,1992(S1):200-202.

[3]胡庭俊,程富勝,陳炅然,等.山豆根多糖體外清除自由基作用的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004(5):6-8.

[4]Hu Tingjun,Zheng Rongliang.Promotion ofSophora subprosrate polysaccharide on nitric oxide and interleukin-2 production in murine T lymphocytes:implicated Ca2+and protein kinase C[J].Int Immunopharmacol,2004,(4):109-118.

[5]孫才華,谷新利,盧 慧.免疫活性多糖作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2006(4):19-21.

[6]龐戰(zhàn)軍,周 玫,陳 瑗.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:260-261.

[7]M eghji P,Nazir S A,Dick D J,et al.Regional workload induced changes in electrophy siology and immediate early gene ex pression in intact in situ porcine heart[J].J Mol Cell Cardiol,1997,29(11):3147-3155.

[8]Koy amaa F C,Chakrabartib D,Garcia C R S.Molecular machinery of sig nal transduction and cell cycle regulation in Plasmodium[J].Mol Biochem Parasitol,2009:165:1-7.

[9]周 慧.簡明生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2006:44-46.

[10]林曙光,鄭廣華,段小貝.細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社,1996:1-9.

[11]陳 龍,龐訓(xùn)勝,毛鑫智,等.雛雞在感染IBDV后血漿cAMP、cGM P和IL-2水平變化[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,1999,30(2):157-163.

[12]石放雄,詹勇,阮 軍,等.801對肉雞血漿和肝臟環(huán)核苷酸含量影響的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,1998(2):5-7.

[13]彭碧文,林建銀,蔣明森.花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物在寄生蟲感染中的信使作用[J].國外醫(yī)學(xué):寄生蟲病分冊,2002,29(5):207-212.

[14]胡庭俊,陳炅然,張 霞,等.蕨麻多糖對小鼠免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37(10):909-991.

[15]王昭金,萬選年.一氧化氮在免疫調(diào)節(jié)中的作用與組織移植[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,1998,4(1):9-12.

[16]侯 敢,黃迪南,楊 明,等.蘆薈多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO生成和iNOS酶活性的影響[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,26(3):20-22.

[17]解慧梅,胡 格,索占偉,等.人參皂甙Rb1和黃芪多糖對微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO、IL-6和 TNF-α的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37(9):903-907.

[18]Kan H,Kataoka-Shirasugi N,Amakawa T.Transduction pathways mediated by second messengers including cAMP in the sugar receptor cell of the blow fly:Study by the whole cell clamp method[J].J Insect Physiol,2008,54:1028-1034.

[19]胡庭俊,程富勝,陳炅然,等.黃芪多糖對小鼠免疫細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2005,36(6):616-619.