陳 鈺，王 捷，劉仲明

骨唾液蛋白納米壓電免疫傳感器陣列的研制

陳 鈺，王 捷，劉仲明

目的以AT切型、10 Hz雙面鍍金的石英晶體為換能器，結(jié)合納米金顆粒獨特的物理化學特性，制作一種用于臨床血清骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）檢測的納米壓電免疫傳感器陣列。方法將納米金顆粒通過1，6-己二硫醇固定在金電極表面，采用巰基化試劑Sulfo-LC-SPDP將鼠抗人BSP單克隆抗體巰基化，并將其固定于修飾有納米金顆粒的石英晶體金電極表面，通過免疫反應檢測正常人和骨質(zhì)疏松患者血清中BSP的表達。 結(jié)果（1）對稀釋度分別為1∶9，1∶8，1∶7，1∶6，1∶5，1∶4，1∶3，1∶2的參考標準血清進行檢測，結(jié)果顯示，在血清稀釋度在1∶9～1∶2的范圍內(nèi)，構(gòu)建的BSP納米傳感器陣列對血清檢測的響應呈較好的線性關(guān)系，線性方程為y=872.66x－58.258，相關(guān)系數(shù)為0.974。（2）初步證明，骨質(zhì)疏松癥患者血清中BSP含量高于正常人血清，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.162，P=0.000）。結(jié)論實驗研制的BSP納米壓電免疫傳感器陣列具有結(jié)構(gòu)簡單、操作容易、穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，可用于BSP的快速定量檢測。

生物傳感技術(shù)；唾液蛋白類；骨質(zhì)疏松；納米金顆粒

作者單位：510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科

骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）是細胞外基質(zhì)中一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白，屬于SIBLINGs蛋白家族。大量研究表明BSP可以反映早期成骨細胞分化水平，是很有潛力的骨更新標志物[1-10]。血清BSP含量在國外已被作為一種新的骨吸收代謝指標用于臨床研究[11]，因此外周血BSP含量的快速定量檢測在骨代謝水平監(jiān)測方面具有十分重要的臨床意義和應用價值。但目前還沒有檢測BSP的金標準，而通常采用的放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析等方法雖然具有靈敏、準確、特異性高等特點，但其在環(huán)保防護、操作速度、定量檢測等方面各有不足之處；盡管有的檢測方法實現(xiàn)了自動化，但由于專用儀器、專用試劑價格昂貴，目前尚不能在實驗室普及應用，因此尋找和建立一種更加準確、穩(wěn)定、特異、靈敏、簡單、實用的血清BSP檢測方法尤為必要[12]。

壓電免疫傳感器結(jié)合了高靈敏的傳感技術(shù)和高特異的免疫技術(shù)，是近年來生物傳感器研究的熱點之一[13-14]。納米顆粒比表面積大、吸附能力強，在壓電石英晶片表面組裝上一層納米金膜可以增加固定的分子數(shù)量，實現(xiàn)信號的放大，提高壓電免疫傳感器的檢測靈敏度；納米顆粒還具有很好的生物兼容性，當免疫材料吸附在納米金膜表面時，膠體表面的離子可以保護蛋白質(zhì)免于因吸附過強而變性[15]?；谏鲜鰞?yōu)點，近年來納米顆粒被廣泛運用于壓電免疫傳感器免疫材料的固定中[16]。本研究采用目前較為理想的巰基自組裝固定技術(shù)[17-22]，并結(jié)合納米金顆粒的獨特性質(zhì)，建立一種納米金增效的壓電免疫傳感技術(shù)，以實現(xiàn)血清BSP表達含量的快速定量檢測。該研究不僅為血清BSP的快速檢測提供新方法、新技術(shù)，還初步驗證了所采用固定化途徑的潛在優(yōu)勢以及將建立的免疫傳感分析技術(shù)用于臨床實際診斷的可行性。圖1即為本研究所構(gòu)建的納米壓電免疫傳感器陣列示意圖。

圖1 納米壓電免疫傳感陣列構(gòu)建示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑

所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

鼠抗人BSP單抗（美國SANT CRUZE公司），牛血清白蛋白、DTT（美國MBCHEM公司），Sulfo-LC-SPDP（美國Pierce公司），納米金顆粒（10 nm，美國Sigma-Adrich公司），丙酮、無水乙醇（廣州化學試劑廠），高純氮氣（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院氧氣房制），Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、HCl、NaOH（廣州化學試劑廠），吐溫-20（美國AMRESCO公司），患者血清、正常血清、參考標準血清（廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗科、血液中心、醫(yī)學實驗科），小牛血清、胎牛血清（美國Hyclone公司）。

1.2 主要儀器

石英晶體微陣列（廣東深圳南星電子有限公司），F(xiàn)PA-01型壓電蛋白芯片分析儀（廣東佛山分析儀有限公司），SGSP-02型電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱（湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司），DK-S22型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司），DL-60型超聲波清洗器（浙江余姚工業(yè)自動化儀表廠）。

1.3 血清標本

均來源于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，其中正常人血清標本為軍人獻血血清，各項指標均正常；患者血清來源于骨質(zhì)疏松癥患者，其中男5例，女2例，年齡48～72歲，平均年齡50.4歲，經(jīng)X線檢查，均有不同程度的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象。

圖2 壓電免疫傳感器陣列示意圖 1石英晶體 2金電極 3彈簧支架 4導線

1.4 實驗方法

1.4.1 陣列的設計與制備

本實驗壓電免疫傳感器包括包被過的石英晶體、振蕩器和頻率計等。石英晶體的厚度切片模式采用AT切割，10 Hz，大小為8 mm×8 mm×0.15 mm，在石英晶片的雙面采用真空鍍膜的方法形成金電極。該陣列由彈簧支架和4個石英晶體組成（圖2）。

1.4.2 石英晶體金電極表面的預處理

石英晶片依次用1.2 mol/L NaOH、1.2 mol/L HCl溶液浸泡10 min，再分別用丙酮、無水乙醇、超純水進行清洗，吹干測頻備用。

1.4.3 抗體的固定

將預處理過的石英晶片浸入5%1，6-己二硫醇中1 h，用無水乙醇和超純水洗滌，吹干測頻；然后在石英晶體金電極的表面各滴加納米金溶液10 μL，4 ℃ 下反應6 h，PBS、超純水洗滌，吹干測頻。20 mmol/L Sulfo-LC-SPDP的水溶液與抗體稀釋液等比混合，室溫孵育1 h，再以3∶2的體積比加入pH 4.5的25 mmol/L的DTT液，室溫孵育30 min以減少硫醇化的抗體二硫鍵的形成?；旌弦旱渭拥接眉{米金顆粒包被的石英晶片上4℃反應20 h后吹干測頻。分別用PBS和超純水清洗，再用20 μL的10%BSA溶液37℃封閉非特異性位點1 h，分別用PBS和超純水清洗，吹干測頻，并于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 血清檢測

在各個通道上滴加1∶4稀釋的臨床血清樣品各10 μL，37 ℃孵育 1 h，分別用PBS和超純水清洗，吹干測頻。

1.4.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，對正常人和骨質(zhì)疏松患者血清中頻率改變量的比較運用單樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體固定濃度的選擇

采用納米金巰基自組裝法固定鼠抗人BSP單克隆抗體，固定量用固定前后的頻率改變量表示。實驗結(jié)果證明，隨著抗體濃度的增加，石英晶體頻率的改變量也隨之增大，由于本實驗所用抗體試劑的最大濃度為100 μg/mL，因此也就無法考察更高濃度與頻率改變量之間的關(guān)系。出于成本和實際響應值的考慮，本實驗采用的抗體濃度為80 μg/mL[12]。

2.2 壓電免疫傳感器陣列的響應特性

2.2.1 pH值對傳感器陣列的影響

pH值是影響免疫反應的一個重要因素，它通過影響抗原-抗體間的親和作用繼而影響免疫復合物的形成量。pH值過高或過低都會影響抗原和抗體的理化性質(zhì)，若pH值達到或接近抗體的等電點時，即使無相應抗原存在，也會引起顆粒性抗體非特異性的凝集，進而影響其在芯片表面的固定以及此后的免疫反應[23]。因此，既要考慮固定時的酸度因素，還應使該pH值處于抗體決定簇與抗體活性部位二者的等電點之間。實驗發(fā)現(xiàn)，傳感器陣列檢測的最佳pH值條件為7.4左右[12]。

2.2.2 壓電免疫傳感器檢測的線性范圍

對稀釋度分別為1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2的參考標準血清進行檢測，考察構(gòu)建的BSP傳感器陣列對血清檢測的響應特性，以測定的頻率改變量對血清稀釋度作圖（圖3）。結(jié)果顯示，在血清稀釋度1∶9～1∶2的范圍內(nèi)，經(jīng)納米金巰基自組裝法固定的陣列在免疫反應后呈較好的線性關(guān)系，線性方程為y=872.66x－58.258，相關(guān)系數(shù)為0.974。

圖3 傳感器頻率改變量與血清稀釋度間的關(guān)系圖

2.2.3 壓電免疫傳感器檢測的特異性

特異性是傳感器能否應用于臨床的關(guān)鍵因素之一。對于壓電免疫傳感器，抗體的選擇尤為重要，本研究平行檢測正常人血清和牛血清，反復檢測6次，以觀察傳感器的特異性反應。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小牛血清以及胎牛血清的頻率改變量為（6.3±7.1）Hz，而正常人血清的頻率改變量為（66.1±10.3）Hz，即小牛血清和胎牛血清的頻率改變量與陰性血清頻率改變量的比值遠小于2∶1。可見該壓電免疫芯片選擇性較好，特異性高，其它動物血清對BSP的檢測干擾很小。

2.3 臨床血清檢測

通過納米金巰基自組裝法對抗體進行固定，采用本實驗研制的壓電免疫傳感器陣列對骨質(zhì)疏松癥（n=7）血清、正常人（n=8）血清樣品進行檢測。結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松癥患者血清中BSP的含量[（251.7±23.7）Hz]高于正常人血清[（66.1±10.3）Hz]，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.162，P=0.000）。

3 小結(jié)

采用納米金巰基自組裝法固定免疫材料，獲得了較大的固定量，在液相反應、氣相檢測的條件下，可以實現(xiàn)壓電石英芯片的穩(wěn)定振蕩。納米金顆粒較高的比表面積使其承載了更多的抗體，同時可較好地保持抗體的反應活性，以其為載體制備的傳感器具有更大的頻率響應值[12]。本實驗的結(jié)果顯示，經(jīng)納米金顆粒增效的BSP壓電免疫傳感器陣列具有結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點，可用于BSP的快速定量檢測，具有一定的臨床應用價值。

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Design of nano-piezoelectric immunosensor array to detect bone sialoprotein

CHEN Yu,WANG Jie,LIU Zhong-ming.Department of Medical Research,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou,Guangdong 510010,China

Objective With the unique properties of Au nanoparticles,a nano-piezoelectric immunosensor microarray was designed using AT-cut 10 Hz quartz crystal to detect blood sialoprotein(BSP)expression from clinical serum.Methods Monoclonal antibody of BSP was thiolated by heterobifunctional cross-linkers Sulfo-LC-SPDP.Next,the hydrosulfuryl-antibodies were fixed on the surface of gold-membrane electrode via Au nanoparticles modified to make a bio-sensitive membrane,which constructed the nano-piezoelectric immunity chips.BSP expression from the serum of healthy adults and patients with osteoporosis were examined after immunoreaction.Results The detection of reference standard serum at dilution of 1∶9,1∶8,1∶7,1∶6,1∶5,1∶4,1∶3 and 1∶2 showed that constructed BSP nano-immunosensor array had good linear relationship with serum detection results when the serum dilution ranged between 1∶9 and 1∶2;the linear equation wasy=872.66x－58.258(correlation coefficient=0.974).The serum BSP expression levels of patients with osteoporosis were higher than those of healthy adults using BSP piezoelectric immunosensor array(t=20.162,P=0.000).Conclusion The BSP nano-piezoelectric immunosensor array can be used for quantitative detection of serum BSP with the advantages of simple structure,easy operation,good stability,high sensitivity and specificity.

Biosensing techniques;Salivary proteins;Osteoporosis;Au nanoparticles

WANG Jie,E-mail:jiew@tom.com

TP212.3，R446.6

A

1674-666X(2010)03-0226-05

2010-04-13；

2010-06-01）

（本文編輯 白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.03.015

廣東省科技計劃項目（2009B030801280，2008A 030203005）

王捷，E-mail：jiew@tom.com