李梓君,方柏山,楊仲麗,劉嘉

(華僑大學工業(yè)生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建泉州 362021)

應用易錯PCR定向進化甘油脫氫酶

李梓君,方柏山,楊仲麗,劉嘉

(華僑大學工業(yè)生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建泉州 362021)

經過連續(xù)易錯聚合酶鏈式反應(Erro r-Prone PCR)向克雷伯桿菌(K lebsiella pneumoniae)甘油脫氫酶基因中引入突變,并構建突變文庫.依據(jù)突變體催化番紅O顯色的特性,采用瓊脂平板法和96微孔板法相結合的高通量篩選方法,成功獲得突變體gldA-74,其酶活力是親本重組酶的2.73倍.通過軟件對突變體gldA-74酶基因和親本重組酶基因進行分析對比,發(fā)現(xiàn)突變體gldA-74酶基因發(fā)生了一處點突變(A 964T),該突變使一處氨基酸被取代.將親本重組酶和進化酶的高效表達產物經Ni柱純化后,酶學性質的測定結果表明,甘油的Km值由0.58 mmol·L-1升高至0.63 mmol·L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol·L-1升高至0.77 mmol·L-1,并且酶的最適p H值由原來的11.5升高至12.5,而最適溫度由65℃降至55℃.

甘油脫氫酶;克雷伯桿菌;定向進化;易錯聚合酶鏈式反應

甘油脫氫酶(Glycerol Dehydrogenase,GDH)主要催化甘油生成二羥基丙酮(Dihydroxyacetone, DHA).根據(jù)催化反應中產物和電子受體的不同,GDH可分為3種類型[1].第1種為依賴NAD+的GDH[2](EC1.1.1.6),主要存在于各種細菌中,如Aerobacter aerogenes,Escherichia coli,Bacillus substilis和Cellu lom onas sp.等.第2種為依賴NADP+的 GDH(EC1.1.1.72和EC1.1.1.56),大多存在于霉菌和動物組織中[3].第3種為不依賴輔酶位于細胞膜上的 GDH,在醋酸菌中發(fā)現(xiàn)存在這類GDH[4].GDH的催化產物DHA因其分子中含3種官能團,化學性質活潑,廣泛參與聚合、縮合等反應,所以被廣泛應用于輕工、醫(yī)藥和食品等行業(yè)[5].由于應用過程中常常需要酶在長時間內,以及在極端環(huán)境中保持較高活性,所以需要對天然的甘油脫氫酶進行改造.酶的定向進化是在體外模擬自然進化的過程,不需事先了解酶的空間結構和催化機制,通過人為地創(chuàng)造特殊的條件,模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇),在體外改造酶基因,并定向選擇出所需性質的突變酶.易錯PCR以其操作簡便、有效等優(yōu)點成為目前應用最為廣泛的進化手段之一[6].本研究利用易錯PCR對克雷伯桿菌中 GDH進行定向進化,以期獲得酶活大幅提高,酶學性質有所改善的突變酶.

1 實驗材料和方法

1.1 菌株與質粒

E.coliBL21(DE3)(p ET-32gldA)的構建,以及表達載體p ET-32a(+)、菌株和質粒的保存,均由華僑大學工業(yè)生物技術福建省高等學校重點實驗室完成.

1.2 試劑

LB培養(yǎng)基.T4 DNA連接酶、dN TPs,限制酶、r Taq酶,購自大連TaKaRa公司.膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自美國Omega公司,輔酶Ⅰ購自Amersco公司,其余試劑均為國產分析純.

1.3 定向進化方法

1.3.1 甘油脫氫酶基因突變體文庫構建 (1)引物.PrimerⅠ為5’-CGTCGGA TCCTACA TGCGCACTTA TTTGAG-3’);PrimerⅡ(5’-AA TGCTCGAGCGAA TTAACGCGCCAGCCAC-3’).

(2)易錯PCR反應體系.20μL體系中含1×Taq DNA聚合酶緩沖液、0.2 mmol·L-1dA TP和dGTP,1 mmol·L-1dCTP和d TTP,6.0～8.5 mmol·L-1M g2+,0.3～0.8 mmol·L-1M n2+,1 mmol·L-1PrimerⅠ和PrimerⅡ,模板DNA為質粒p ET-32gldA約50 ng.其中,M g2+和M n2+的濃度被調整,可以得到不同突變頻率的文庫.

(3)擴增與鑒定.94℃,5 min;94℃,1 min;62℃,1.5 min;72℃,1.5 min;30個循環(huán);72℃,15 min.用質量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定易錯PCR產物,利用膠回收試劑盒切膠回收PCR產物,于-20℃保存.

(4)文庫構建.將上述易錯PCR產物經膠回收純化后,經Bam H I-XhoⅠ雙酶切,與同樣雙酶切的載體p ET-32a(+)相連接,重組子引入E.coliBL 21(DE3),構建突變體文庫.

1.3.2 突變體的篩選和鑒定 (1)篩選模型的建立[7].將菌體用無菌水稀釋,涂布于番紅O篩選平板(胰蛋白胨6.0 g·L-1,酵母浸膏 3.0 g·L-1,氯化鈉 10.0 g·L-1,甘油 18.4 g·L-1,番紅O 0.1 mmol·L-1,IPTG 1.0 mmol·L-1,氨芐青霉素75.0 mg·L-1,瓊脂粉10.0 g·L-1),觀察平板的單菌落的生長及變色情況.挑取顏色顯示均勻桃紅色的單菌落置于含75 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),經乳糖誘導后收集菌體進行復篩鑒定.

(2)陽性轉化子的鑒定.按質粒提取試劑盒方法抽提正向重組質粒,經 HindⅢ,PstⅠ單雙酶切,用質量分數(shù)為0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物.

1.4 誘導表達

挑取陽性克隆單菌落接種于含有75 m g·L-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,于30℃培養(yǎng)至吸光度值(D)約0.4時,加入乳糖至終質量濃度為2 g·L-1,于30℃下誘導培養(yǎng)5 h后離心收集菌體.

1.5 進化酶酶活力及菌體蛋白含量測定

酶活力測定具體方法參照文[8].GDH使甘油脫氫生成二羥基丙酮,同時輔酶 ⅠNAD+被還原為NADH.NADH在340 nm的紫外光下有最大吸收,根據(jù)吸光度的增加情況,用初速度法可測定 GDH的活力.取1.5 mL反應液(含30 mmol·L-1(NH4)2SO4,0.2 mol·L-1甘油,2 mmol·L-1NAD,1 μmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2,0.1 mol·L-1碳酸鉀緩沖溶液,p H=12.0),于45℃下恒溫后,加入適量酶液啟動反應,在340 nm波長下連續(xù)測定酶反應過程中的吸光值(每隔6 s記錄一個數(shù)據(jù),時間1 min),通過計算可得到GDH的酶活(z).酶活的定義:在上述條件下,每分鐘還原1μmol甘油的酶量為1個酶活力單位.蛋白含量按Bradford法測定[9],以牛血清白蛋白為標準蛋白質.

1.6 突變基因序列測定

對篩選到的陽性克隆進行培養(yǎng)復篩,挑選在高p H值條件下仍有較高酶活力的突變體,提取質粒并用自動序列儀進行測序.測序由遼寧省大連寶生物公司完成.

1.7 進化酶的純化

按照常規(guī)方法進行鎳柱親和層析純化[8].SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺膠體電泳):采用12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳,考馬斯亮藍G-250染色.

2 實驗結果

2.1 易錯聚合酶鏈式反應

在高離子濃度M g2+或M n2+存在的條件下,Taq DNA聚合酶的保真性大大降低.在延伸的過程中,一些堿基被錯誤地引入到基因中,從而使基因發(fā)生突變.通過改變M g2+和M n2+的濃度,可以得到不同突變頻率的片段多樣性文庫.在其他成分恒定的條件下,選擇不同濃度的M g2+,M n2+進行易錯PCR,結果如圖1所示.圖1(a)中,1～6表示M g2+濃度分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5 mmol·L-1;圖1(b)中,1～6表示M n2+濃度分別為0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mmol·L-1.

從圖1可知,M gCl2濃度范圍在7.0～8.5 mmol·L-1間均適合該基因易錯PCR反應.為了確保易錯PCR的突變率控制在每個基因1～3個堿基突變,選擇M gCl2濃度7.0 mmol·L-1作為該基因易錯PCR反應體系的最適濃度.在以上實驗得到的最適M gCl2濃度的基礎上,進一步考察不同M n2+濃度對反應體系的影響.結果表明,M n2+最適濃度為0.5 mmol·L-1.

圖1 不同離子濃度下的易錯PCRFig.1 Erro r-p rone PCR conducted with different ion concentration

2.2 突變體文庫的構建及突變株的篩選和鑒定

在確定的易錯PCR條件下擴增甘油脫氫酶基因,經連續(xù)易錯PCR,產物經純化后用Bam HⅠ-XhoⅠ雙酶切,與經過同樣雙酶切的表達載體p ET-32a(+)相連接.連接產物轉化至E.coliBL 21(DE3)感受態(tài)細胞中構建突變文庫.研究中共獲得5 000余株的突變株.

2.2.1 突變株的初篩 將轉化后的E.coliBL 21(DE3)細胞涂布于番紅O篩選平板上,在37℃下培養(yǎng)約12 h,對突變體進行篩選.甘油脫氫酶在催化甘油生成二羥基丙酮的同時,把 NAD+轉化成NADH.所生成的NADH會通過呼吸鏈使電勢升高,產生強質子流,增強了大腸桿菌細胞對番紅O的攝入,并使得番紅O在大腸桿菌內聚集[7,10].通過番紅O篩選平板涂布,具有甘油脫氫酶活性的克隆顯示均勻的桃紅色,而無活性的克隆外圍則有一個透明圈,如圖2所示.

圖2 番紅O篩選平板初篩結果Fig.2 The screening result in safranin O plates

2.2.2 突變株的復篩 將初篩獲得的克隆子接種于LB培養(yǎng)基(含75 mg·L-1氨芐青霉素)中,在30℃下培養(yǎng)至D約0.4時,加入乳糖至終質量濃度為2 g·L-1;30℃誘導培養(yǎng)5 h后,超聲破碎菌體并離心收集上清液.采用96孔板結合酶標儀,測定初篩獲得的菌株在不同p H值下的酶活,最終獲得最佳突變體gldA-74,其甘油脫氫酶活力為2.202 m kat·L-1.

相比由張婷婷等[8]構建的親本重組酶(酶活為0.805 mkat·L-1),酶活提高2.73倍;而相比于陳宏文等[1]由出發(fā)菌克雷伯桿菌經培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后,所測得無細胞抽提液的酶活0.062 m kat· L-1,酶活提高35.7倍.

2.2.3 突變株酶切鑒定結果 將均勻桃紅色的克隆子在LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),然后抽提重組質粒.重組質粒用HindⅢ進行單酶切鑒定時,應出現(xiàn)約6 987 bp大小的一條帶;而用 HindⅢ/PstⅠ進行雙酶切鑒定時,由于gldA-74上還存在兩個PstⅠ酶切位點,應得到兩條DNA條帶,其大小分別約為4 808,1 584 bp.

酶切鑒定結果表明連接正確,如圖3所示.圖3中:1,2分別為經 HindⅢ和經 HindⅢ/PstⅠ進行酶切p ET-32gldA-74.

2.2.4 進化酶與親本重組酶序列比較結果 突變后的基因委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序,將進化酶與親本重組酶基因序列進行對比.測序結果表明,利用易錯PCR的方法,成功地向甘油脫氫酶基因引入了突變,其中酶活力增高、最適p H值增大的gldA-74突變體酶基因有1個堿基發(fā)生了突變(即964位的A變?yōu)門).這處突變使得322位的I(異亮氨酸)突變?yōu)镕(苯丙氨酸).

2.3 甘油脫氫酶的分離與純化

選用的表達載體p ET-32a(+)中含有表達His6-Tagged的基因序列,進化酶含有該融合標簽,可以用鎳柱純化.另外,在該進化酶的N端還含有一個Rrx-Tag TM,該融合標簽有利于提高目的蛋白的可溶部分比例及活性.研究中,進化酶經鎳柱親和層析純化后可見單一條帶,而穿透液幾乎不含該條帶,基本上可以認為得到比較純的蛋白.

當以p ET-32a(+)為表達載體時,表達的目標蛋白所含的融合基因的相對分子質量約為20.4 ku,而研究中的 GDH的相對分子質量約為34 ku[1].因此,突變質粒所表達的融合蛋白的相對分子質量應為54 ku,如圖4所示.圖4中:1,2,3分別為純蛋白、穿透液和粗蛋白.

表1為純化結果.表1中:mt為總蛋白量;zt為總活力;ρ為蛋白質量濃度;σ為比活力;η為回收率;n為純化倍數(shù).從表1可以看出,純化后進化酶的回收率為24.1%,純化倍數(shù)是2.1.

圖3 表達載體酶切鑒定Fig.3 Enzyme digestion of exp ression vector

圖4 進化酶的純化Fig.4 Purification of evolved emzyme

表1 進化GDH的純化Tab.1 Purification of evolved GDH

2.4 甘油脫氫酶的酶學性質分析

2.4.1 酶動力學參數(shù)比較 親本重組酶與進化酶都以1/V和1/S作Lineweaver Burk雙倒數(shù)圖,結果如圖5所示.由此計算,得到親本重組酶的Km(甘油)為0.58 mmol·L-1,Km(NAD)為0.74 mmol· L-1,Vmax(甘油)為0.75 mmol·(L·min)-1,Vmax(NAD)為0.96 mmol·(L·min)-1;進化酶的Km(甘油)為0.63 mmol·L-1,Km(NAD)為0.77 mmol·L-1,Vmax(甘油)為3.69 mmol·(L·m in)-1,Vmax(NAD)為4.75 mmol·(L·min)-1.

2.4.2 最適溫度比較 親本重組酶與進化酶的最適反應溫度,如圖6所示.從圖6可見,親本重組酶的最適溫度為65℃,說明GDH能在較高的溫度下進行反應.但是,再繼續(xù)升高溫度,酶活力迅速下降;在70℃時,殘留的相對酶活力僅有20%.由圖6又可知,進化酶的最適溫度為55℃,比親本重組酶的最適溫度降低了10℃.在50～60℃范圍內,進化酶的相對酶活均維持在80%以上.

2.4.3 最適p H值的比較 在45℃,不同p H值的緩沖液中,檢測親本重組酶和進化酶活力,結果如圖7所示.由圖7可以看出,甘油脫氫酶的酶活隨著反應液p H值的變化而變化.親本重組酶在p H值為11.0時,甘油脫氫酶的酶活最大;而在p H值為10～12時,GDH的相對活性能保持在70%以上.

圖5 酶動力學參數(shù)的Line weaver Burk雙倒數(shù)圖Fig.5 Enzyme kinetic parameters of the Line weaver Burk double-reciprocal graph

由圖7還可以看出,進化酶在p H值為12.5時酶活最大,比親本重組酶的最適p H值高.在p H值為10～13時,進化酶的相對活性能保持在70%以上.中性環(huán)境酶活損失很大,在p H值為7的條件下,酶活僅為20%左右.進化酶催化反應耐強堿,說明 GDH存有較大的工業(yè)應用價值.

圖7 pH值對酶活力的影響Fig.7 the effect of reaction pH on the specific activity of recombinant GDH and evolved GDH

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on the activity of recombinant GDH and evolved GDH

3 討論

易錯PCR操作簡單,容易引入點突變.其突變頻率高于傳統(tǒng)的物理和化學誘變,是目前定向進化領域最為常用的隨機突變手段.因此,采用易錯PCR對GDH進行定向進化.

首先運用番紅O篩選平板對5 000余株突變體進行初篩;然后,再利用96孔板結合酶標儀測定經初篩所得的菌株在不同p H值條件下的酶活,最終成功獲得突變體gldA-74.該突變體有一個有益突變(即I322F),使得進化酶的酶活是親本重組酶的2.73倍.

將親本重組酶和進化酶的高效表達產物經鎳柱純化后,其酶學性質測定表明:Km(甘油)由0.58 mmol·L-1升高至0.63 mmol·L-1,Km(NAD)由0.74 mmo l·L-1升高至0.77 mmol·L-1,并且酶的最適p H值也由11.5升高至12.5,最適溫度由65℃降至55℃.綜上所述,最終獲得的突變體gldA-74與親本重組酶相比,具有較高的催化活力和偏堿的最適p H值,更適合在偏堿的環(huán)境中應用.

今后的研究方向有以下幾個方面:(1)應用生物信息學工具,對定向進化后的突變基因庫、蛋白質序列、3D結構、活性與功能的變化等做比對分析;(2)從根本上揭示突變酶的催化機理和折疊機制、蛋白質一級序列與三級結構的關系,以及結構與功能的關系等,為探索酶法同時合成DHA和1,3-PD的新途徑提供理論依據(jù).

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(責任編輯:黃仲一英文審校:陳國華)

Directed Evolution of Glycerol Dehydrogenase by Error Prone PCR

L IZi-jun,FANGBai-shan, YANG Zhong-li,L IU Jia
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Fujian Province,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

The GDH enzyme gene fromKlebsiella pneumoniaewas repeatedly amp lified by two sequential error-prone polymerase chain reaction(PCR),and the gene library was built.The mutant can catalyze safranin O to show colors,and on the base of this property,the gldA-74 mutant was obtained by high throughput screening method using active agar plates in combination with 96-wellmicrop lates.The activity of the gldA-74 mutant was showed 2.73 fold of that of the parent recombinase.Gene analysis of the gldA-74mutant indicated that the mutant enzyme had a pointmutation(A 964T) which resulted in an amino acid being rep laced.Then,the highly exp ressed productions of recombinase GDH and evolved GDH were purified by Ni-NTA and the enzymatic properties were determined.The results showed that theKmof GDH increased from 0.58 mmol·L-1to 0.63 mmol·L-1,and theKmof NAD increased as well,from 0.71 mmol·L-1to 0.77 mmol·L-1.The op timum pH of mutant enzyme also increased from 11.5 to 12.5 while the op timum temperature decreased from 65℃to 55℃.

glycerol dehydrogenase;Klebsiella pneumoniae;directed evolution;error-prone polymerase chain reaction

Q 554+.903

A

1000-5013(2010)06-0661-06

2008-12-28

方柏山(1957-),男,教授,主要從事生物化工的研究.E-mail:fangbs@hqu.edu.cn.

國家重點基礎研究發(fā)展(973)計劃項目(2006AA 020103);國家自然科學基金資助項目(20676048)