張 銀，佟 平，麻小娟，李 欣，陳紅兵,*

熱加工及超高壓處理對卵白蛋白抗原性的影響

張 銀1,2，佟 平1,3，麻小娟1,2，李 欣1,3，陳紅兵1,3,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌330047；3.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047)

以蛋清為原料，采用加熱加工、動態(tài)超高壓加工及兩種方法結(jié)合處理，研究不同加工方式對蛋清中卵白蛋白抗原性的影響。結(jié)果表明：卵白蛋白抗原性隨著加熱溫度的升高而降低，最高降低68%，且抗原性急劇降低的臨界溫度是80℃；經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后，其抗原性隨著壓力的升高先降低后回升；經(jīng)二者結(jié)合處理后，卵白蛋白抗原性與單獨加熱處理變化趨勢相似，但無單獨熱處理變化幅度大，最高降低52.5%；表明了熱處理對卵白蛋白抗原性的影響比超高壓大，結(jié)果為研發(fā)低致敏性或無致敏性蛋制品提供參考。

加熱；動態(tài)超高壓微射流；卵白蛋白；雞蛋過敏

雞蛋中含有大量的維生素和礦物質(zhì)及有高生物價值的蛋白質(zhì)，是人類食物蛋白最好的來源之一。但雞蛋也是世界糧農(nóng)組織(FAO)認定的八大食物過敏原之一[1]。近年來雞蛋過敏疾病的發(fā)生率呈上升趨勢，而且以嬰幼兒和兒童為主，在此類人群的食物過敏中，雞蛋過敏就占了35%[2]，甚至超過了牛奶過敏[3]。雞蛋中的過敏原主要包括卵類黏蛋白(Gal d1)、卵白蛋白(Gal d2)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gal d3)、溶菌酶(Gal d4)。其中卵白蛋白(ovalbumin，OVA)在雞蛋中含量最多，占蛋清蛋白的54%，具有很好的營養(yǎng)價值和功能特性，常被用于食品配料中[4]。另外，卵白蛋白分子質(zhì)量為45kD，等電點是pH4.5。

蛋白質(zhì)在經(jīng)不同的物理、化學(xué)等加工處理后，它的結(jié)構(gòu)會發(fā)生一系列變化，而蛋白結(jié)構(gòu)的改變會對其免疫學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。在以往的一些臨床研究中[5-7]已有報道，一些雞蛋過敏人群食用熱加工處理后的雞蛋所產(chǎn)生的陽性過敏反應(yīng)可降低甚至消除；Hildebrandt等[8]用消毒處理的雞蛋為原料，通過一系列的加熱與酶解處理后發(fā)現(xiàn)其過敏原性可降低至1%；Iametti等[9]指出，卵白蛋白經(jīng)超高壓處理后，其抗原性可降低至40%，但關(guān)于超高壓后再加熱以及單純加熱對蛋清中的卵白蛋白過敏原性的影響目前還未見報道。本研究對雞蛋蛋清分別進行熱處理、加壓處理及二者先后處理，采用間接ELISA方法對其中的卵白蛋白抗原性進行評估，旨在探索熱處理、加壓處理對卵白蛋白抗原性的影響，為開展低過敏或無過敏的蛋制品研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羊抗兔IgG:HRP酶標二抗、OPD底物 美國Sigma公司；抗卵白蛋白兔多克隆抗體(效價1:25000) 實驗室利用常規(guī)免疫途徑自制；96孔可拆酶標板 深圳金燦華實業(yè)有限公司。

Model 860酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Bio-Rad公司；M-700型微射流均質(zhì)機 美國Microfluidics公司；雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋清分離及處理

雞蛋去殼，取蛋清用水稀釋1倍，調(diào)pH值至6.0，攪拌3h，于3000×g離心3min，取上清，上清再調(diào)pH值至8.0，于2500×g離心30min取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋清中蛋白質(zhì)量濃度測定

采用Lowry法[10]測定。

1.2.3 蛋清加熱

將已處理蛋清用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋至1.5μg/mL，于水浴鍋中進行加熱，加熱溫度分別為55、60、70、80、85、90、95、100℃；每個溫度分別于5、15、30、45、60min各取出一管，立即放于冰上冷卻至室溫。

1.2.4 超高壓處理

將蛋清用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋至1.5μg/mL，過微射流均質(zhì)機處理，均質(zhì)壓力分別為40、60、90、120、150、180MPa，處理后立即做抗原性評估，其余部分－40℃保存。

1.2.5 超高壓樣品加熱處理

選?。?0℃儲存的40、90、180MPa超高壓處理后的蛋清進行加熱處理，加熱溫度為60、70、80、90、100℃。

1.2.6 抗原性評估

采用間接ELISA法對加工后樣品進行抗原性評估：將上述處理好的蛋清與未加工蛋清(1.5μg/mL)分別包被96孔酶標板，每個樣品包被3孔，其中一孔作為陰性對照，4℃孵育過夜；用5g/100mL脫脂乳37℃封阻1h，TBST洗板后加入1:15000稀釋的抗OVA兔血清和陰性血清，37℃孵育1h；再次洗板后加入1:104稀釋的HRP酶標羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1h；洗板后加OPD底物顯色、終止、在490nm波長處比色。每板平行做兩次，取平均值。

式中：At為在t時刻蛋清中卵白蛋白的吸光度；A0為未加工蛋清中卵白蛋白的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清蛋白質(zhì)量濃度測定

將蛋清進行攪拌離心處理，去除大部分雜蛋白及黏蛋白后，用Lowry法測定蛋清蛋白的質(zhì)量濃度。以牛血清白蛋白(BSA)標準品作標準溶液，制作標準曲線如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標準曲線Fig.1 Standard curve for determining protein concentration

由圖1可知，BSA在0～250μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，將蛋清稀釋適當倍數(shù)后，按1.2.2節(jié)測定步驟于500nm波長處測其吸光度，從標準曲線中查知蛋清中蛋白質(zhì)量濃度為80.76mg/mL。

2.2 加熱對卵白蛋白抗原性的影響

圖2 加熱溫度對卵白蛋白抗原性的影響Fig.2 Change of ovalbumin antigenicity during single heat treatment at various temperatures

由圖2、3看出，55℃低溫加熱時，蛋清中的卵白蛋白抗原性降低，但變化幅度不大，最高僅降低了8.92%，且隨著加熱時間的延長變化不明顯；60℃加熱時，卵白蛋白抗原性隨著加熱時間的延長也略有降低，但加熱至60min，其抗原性突然升高，但仍然低于未加熱樣品；在70℃條件下加熱5～45min，卵白蛋白抗原性略有升高，平均比未加熱樣品高4.2%，而加熱60min后抗原性開始降低；當溫度升高到80℃時，卵白蛋白抗原性急劇降低；繼續(xù)加熱，溫度越高，加熱時間越長，抗原性越低，最高可降低68%。但當加熱溫度超過90℃時，在加熱時間范圍內(nèi)抗原性隨溫度變化不明顯，趨于平穩(wěn)。

圖3 不同加熱溫度和加熱時間對蛋清中卵白蛋白抗原性變化程度的影響Fig.3 Effects of heat temperature and time on the changing extent of ovalbumin antigenicity during single heat treatment

加熱可改變蛋白質(zhì)的抗原性是由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化引起的，蛋白質(zhì)加熱后在一些共價或非共價作用下形成分子內(nèi)或分子間聚合物，這種聚合物在一定程度上掩蓋了蛋白過敏原表位，進而影響蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性[11]。Kato等[12]在早年的研究中表明蛋清熱處理會造成卵白蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，使卵白蛋白分子內(nèi)α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)化，分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的交聯(lián)使分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出疏水基團，進而產(chǎn)生聚合物。涂宗財?shù)萚13]的研究中也指出在卵白蛋白分子凝集過程中，起主要作用的是分子間β-折疊結(jié)構(gòu)。每分子卵白蛋白中含有1個二硫鍵和4個巰基[14]，在高溫處理下，隨著β-折疊結(jié)構(gòu)的交聯(lián)卵白蛋白分子多肽鏈被打開，充分變性和伸展，暴露出內(nèi)部疏水性巰基基團，隨著溫度的增加，巰基發(fā)生氧化或與二硫化物交換，形成新生二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生締合物[15]。卵白蛋白多肽鏈的打開與聚合物的生成都會影響卵白蛋白抗原性。

在蛋清加熱過程中，加熱溫度為55、60℃時，卵白蛋白抗原性降低不明顯，估計是低溫加熱使卵白蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出部分疏水基團，掩蓋了部分過敏原表位，進而降低其抗原性，但是由于這兩個加熱溫度較低，卵白蛋白結(jié)構(gòu)變化不顯著，抗原性降低不明顯；而在60℃加熱60min，隨著加熱時間的增長，分子內(nèi)部隱藏的表位開始暴露出來，使卵白蛋白抗原性略有回升，直至70℃加熱5min，在這個過程中，卵白蛋白分子的展開一方面暴露出疏水殘基而趨于聚合，一方面掩藏在分子內(nèi)部的表位暴露出來，大量暴露的表位掩蓋了前一種作用而使卵白蛋白抗原性較未加工樣品略有升高；隨著加熱時間的增長，暴露的疏水基團增加，至70℃加熱60min后，這兩種作用基本相平，卵白蛋白抗原性降低至與未處理樣品相似；加熱溫度超過70℃以上，隨著溫度的升高，卵白蛋白分子充分伸展，暴露的巰基基團使分子間形成二硫鍵，促進蛋白質(zhì)分子間相互作用而產(chǎn)生大量締合物，使卵白蛋白抗原性大幅度降低。由圖可以推測，卵白蛋白分子發(fā)生這一變化的臨界溫度在80℃。

2.3 超高壓對卵白蛋白抗原性的影響

圖4 超高壓對卵白蛋白抗原性的影響Fig.4 Change of ovalbumin antigenicity with pressure during high-pressure microfluidization

由圖4可知，蛋清經(jīng)超高壓處理后，卵白蛋白抗原性隨著壓力的升高程“U”型分布。在40～90MPa壓力下，卵白蛋白抗原性隨壓力的升高而下降；在120MPa下，卵白蛋白抗原性開始略有回升；當壓力到180MPa，卵白蛋白抗原性基本與未處理相同。但是可以看出，在實驗壓力范圍內(nèi)，卵白蛋白抗原性變化幅度較小，最大僅變化了15%左右。

動態(tài)超高壓微射流均質(zhì)技術(shù)是一種高效的超微細化技術(shù)，樣品在加工過程中受到高速撞擊、瞬間剪切、空穴爆炸等機械力作用，可能導(dǎo)致大分子結(jié)構(gòu)的變化與性質(zhì)改變[16]。高壓處理與熱處理對蛋白分子的影響有一定的相似之處，涂宗財?shù)萚13]指出：在高壓影響下，分子間β-折疊結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生導(dǎo)致卵白蛋白分子間交聯(lián)的增加，促進了二硫鍵的形成與交換，進而形成密度較大的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這與前述熱處理對卵白蛋白結(jié)構(gòu)的影響相似，蛋白質(zhì)的凝聚使卵白蛋白抗原性降低。但是高壓處理下，卵白蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了多方面的變化。王輝等[17]報道了蛋清蛋白在壓力影響下，疏水基團含量隨著壓力的升高而升高，但超過100MPa后又呈下降趨勢，并指出：高壓處理一方面使蛋清蛋白的大分子展開，由于蛋白質(zhì)分子間相互作用增強而導(dǎo)致蛋白分子有相互凝聚的趨勢；另一方面，蛋清蛋白質(zhì)經(jīng)超高壓處理后，大的凝聚體被打破，使得更多可溶性活性聚合體產(chǎn)生，促進蛋白質(zhì)與水之間的作用力，從而降低蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，阻止蛋白分子的凝聚。推測在40～90MPa壓力下，卵白蛋白分子充分展開，疏水基團的暴露使其抗原性降低，而在120～180MPa處理下，卵白蛋白分子一方面在β-折疊結(jié)構(gòu)交聯(lián)的作用下形成聚合體，一方面由于壓力較大，已形成的一些凝聚體又被打破成為可溶性聚合體，使卵白蛋白抗原性有所回升，至180MPa條件下，兩種主要作用力基本達到相互平衡，所以其抗原性與未處理樣品基本相同。

2.4 超高壓樣品加熱對卵白蛋白抗原性的影響

選取卵白蛋白抗原性差異相對較大的40、90、180MPa超高壓樣品(－40℃儲存)再進行加熱處理，用與前面相同的間接ELISA法評估卵白蛋白抗原性，評價二者對卵白蛋白抗原性影響的關(guān)系，結(jié)果如圖5～7所示。

圖5 40MPa處理后加熱不同溫度對卵白蛋白抗原性的影響Fig.5 Antigenicity change of 40 MPa treated ovalbumin during heat treatment at various temperatures

圖6 90MPa處理后加熱不同溫度對卵白蛋白抗原性的影響Fig.6 Antigenicity change of 90 MPa treated ovalbumin during heat treatment at various temperatures

圖7 180MPa處理后加熱不同溫度對卵白蛋白抗原性的影響Fig.7 Antigenicity change of 180 MPa treated ovalbumin during heat treatment at various temperatures

由圖5～7可知，蛋清經(jīng)超高壓后再加熱，卵白蛋白的抗原性比單純超高壓處理要低，且隨溫度的升高而降低。與圖2比較可知，蛋清超高壓后再加熱，卵白蛋白抗原性在不同溫度間的變化與單純熱處理的變化相似，不同的是，在70℃條件下加熱并沒有出現(xiàn)卵白蛋白抗原性較未加工樣品增高的趨勢，這可能因為超高壓已破壞了卵白蛋白分子結(jié)構(gòu)，隱藏的表位未暴露出來或蛋白分子的凝集掩蓋了暴露的表位對抗原性的影響；還可以看出，蛋清超高壓后再加熱，卵白蛋白抗原性最高下降了52.5%，而單純熱處理樣品，卵白蛋白抗原性最高下降了68%，這可能因為超高壓處理對卵白蛋白分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了如2.3節(jié)所述的復(fù)雜影響，卵白蛋白分子粒度的降低促進了蛋白質(zhì)與水之間的作用力，在加熱時這種作用力可能對蛋白分子間凝集起一定的阻止作用。另外，在40、90、180MPa超高壓處理后，冷凍保存也會影響卵白蛋白的抗原性，其數(shù)值均比未冷凍保存的數(shù)值低(圖4～7)。

3 結(jié) 論

超高壓及熱處理對蛋清中卵白蛋白抗原性均有不同程度的影響，熱處理可降低卵白蛋白抗原性，最高可降低68%，但不能達到完全消除的效果；單純超高壓對卵白蛋白抗原性的影響呈先減后增的趨勢，但變化幅度僅有15%；超高壓樣品再加熱也可降低卵白蛋白抗原性，但沒有單純熱處理變化大。所以得出結(jié)論：熱處理比超高壓更能降低卵白蛋白抗原性。超高壓處理對卵白蛋白結(jié)構(gòu)的影響較復(fù)雜，曾有報道[9]指出，在800MPa壓力下，卵白蛋白抗原性可降低60%?；趯嶒灄l件限制，本實驗僅選擇40～180MPa壓力處理，更高壓力處理對卵白蛋白抗原性的影響有待進一步研究；另外，蛋清樣品冷凍儲存所造成的對卵白蛋白抗原性的影響也有待進一步研究。

[1]ZWIETERING M. Practical considerations on food safetyobjectives[J]. Food Control, 2005, 16(9): 817-823.

[2]MINE Y, RUPA P. Immunological and biochemical properties of egg allergen[J]. World Poultry Sci J, 2004, 60: 321-330.

[3]SAMPSON H A. Update on food allergy[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(5): 805-819.

[4]MINE Y. Recent advances in egg protein functionality in the food system[J]. Worlds Poultry Sci J, 2002, 58: 31-39.

[5]URISU A, ANDO H, MORITA Y, et al. Allergenic activity of heated and ovomucoid-depleted egg white[J]. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100 (2): 171-176.

[6]EIGENMANN P A. Anaphylactic reactions to raw eggs after negative challenges with cooked eggs[J]. J Allergy Clin Immunol, 2000, 105(3): 587-588.

[7]WADA E, URISU A, MORITA Y, et al. Assessment of allergenic activity of heated and ovomucoid-depleted egg white[J]. Arerugi, 1997, 46 (10): 1007-1012.

[8]HILDEBRANDT S, KRATZIN H D, SCHALLER R, et al. in vitro Determination of the allergenic potential of technologically altered hen s egg[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(5): 1727-1733.

[9]IAMETTI S, DONNIZZELLI E, PITTIA P, et al. Characterization of high-pressure-treated egg albumen[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(9): 3611-3616.

[10]LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. Protein measurment with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951, 193 (1): 265-275.

[11]解冠華, 陳紅兵. 加工對牛乳過敏原的影響[J]. 食品科學(xué), 2006, 27 (11): 598-601.

[12]KATO A, TAKAGI T. Formation of intermolecular beta-sheet structure during heat denaturation of ovalbumin[J]. Agric Biol Chem, 1988, 36 (6): 1156-1159.

[13]涂宗財, 遲海霞, 劉成梅, 等. 動態(tài)超高壓微射流對卵清蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(3): 4-6.

[14]宋宏新, 梁艷. 雞蛋清中三種主要蛋白質(zhì)的連續(xù)化提取分離研究[D].西安: 陜西科技大學(xué), 2006.

[15]魏曉芳, 劉會洲. 熱變性對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及泡沫行為的影響[J]. 化工冶金, 2000, 21(4): 381-382.

[16]YOCUM M W, BUTTERFIELD J H, KLEIN J S, et al. Epidemiology of anaphylaxis in Olmsted County: A population-based study[J]. J Allergy Clin Immunol, 1999, 104(2 Pt 1): 452-456.

[17]王輝. 蛋清蛋白動態(tài)超高壓微射流改性研究及機理初探[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2007.

Respective and Combined Effects of Heat and High-pressure Treatments on the Antigenicity of Egg White Ovalbumin

ZHANG Yin1,2，TONG Ping1,3，MA Xiao-juan1,2，LI Xin1,3，CHEN Hong-bing1,3,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Single heat treatment and high-pressure microfluidization and their combination were used to process egg white in order to study the effects of different processing approaches on the antigenicity of egg white ovalbumin. The results indicated that the antigenicity of heat-treated ovalbumin decreased by up to 68% with increasing temperature. The critical temperature for a steep decrease of ovalbumin antigenicity was 80 ℃. The change in antigenicity of high-pressure-treated ovalbumin exhibited an initial decrease, followed by a rebound increase. During single heat treatment and combination of heat treatment and highpressure microfludization, the antigenicity of egg white ovalbumin had a similar changing trend, but the change extent during combination of heat treatment and high-pressure microfludization was comparatively less, up to only 52.5%. Thus, heat treatment had more effect on ovalbumin antigenicity than high-pressure microfluidization. This conclusion is helpful for the development of hypoallergenic or non-allergenic egg products.

heat treatment；high-pressure microfludization；ovalbumin；egg allergy

Q518.4

A

1002-6630(2010)19-0250-04

2010-06-27

教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目(NCET-08-07-04)；南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索項目(SKLF-TS-200820)；江西省自然科學(xué)基金項目(2008GZN0040)

張銀(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品衛(wèi)生與安全。E-mail：zhangyin221@126.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：chbgjy@hotmail.com