李月玲,張?zhí)?彭士明,張鶴云

南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室,南京 210093

望江南總蒽醌苷抗腫瘤作用的研究

李月玲,張?zhí)?彭士明,張鶴云＊

南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室,南京 210093

探討望江南總蒽醌苷(CSAG)的抗腫瘤作用及其作用機制。利用MTT法檢測望江南總蒽醌苷對肝癌細(xì)胞 HepS、肺癌細(xì)胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹水型腫瘤細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞 L-02增殖的影響;實體瘤稱重法測定 CSAG對肝癌(HepS)實體瘤的抑制情況,將接種腫瘤的小鼠分成 5組,每組 6只小鼠,雌雄各半,給藥 12 d,停藥后 24 h處死動物,秤鼠體重,剝離出腫瘤,秤瘤重,測定生化指標(biāo)。結(jié)果顯示,CSAG對以上腫瘤細(xì)胞的增殖均有抑制作用,對肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長具有明顯的抑制作用;同時可增加胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。因此,CSAG具有明顯的抗腫瘤效果,其抗腫瘤作用可能與提高機體免疫力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

望江南總蒽醌苷;抗腫瘤;肝癌細(xì)胞 HepS;免疫;細(xì)胞凋亡

望江南 (Cassia occidentalisL.),豆科,決明屬,又名羊角豆、野扁豆,主要分布于長江以南各地,望江南的種子、根、莖、葉都可入藥,是民間一種常用的中藥,在臨床上也有應(yīng)用。望江南的主要活性成分為蒽醌苷類化合物,由蒽醌類衍生物與糖結(jié)合而成,具有抗菌消炎、瀉下、抗風(fēng)濕等作用。盡管望江南民間應(yīng)用療效確切[1],國內(nèi)外學(xué)者對其藥理活性和化學(xué)成分也進(jìn)行了初步研究,但是目前仍然很難依據(jù)現(xiàn)有研究資料對其進(jìn)行合理開發(fā)和利用。從國內(nèi)外的文獻(xiàn)報道來看,目前對望江南的藥理活性研究主要限于其抗炎作用。本實驗對望江南總蒽醌苷體內(nèi)外抗腫瘤作用進(jìn)行了研究,以期為開發(fā)傳統(tǒng)中藥提供科學(xué)依據(jù),使望江南得到更有效的利用。

1 材料

1.1 實驗動物及瘤株

昆明種小白鼠,雌雄各半,18～22 g,購于南京醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心,清潔級。肝癌 HepS細(xì)胞株由中科院上海藥物研究所提供,江蘇省腫瘤研究所培養(yǎng)傳代。肺癌細(xì)胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹水型腫瘤細(xì)胞、人正常肝細(xì)胞 (L-02)本實驗室凍存。

1.2 主要試劑及儀器

望江南總蒽醌苷樣品 (自制,純度為 95.3%); RPM I-1640細(xì)胞培養(yǎng)液 (G IBCO公司,批號: 2535081);四噻唑氮藍(lán)MTT(南京大治生物科技有限公司,批號:0793);環(huán)磷酰胺 (江蘇恒瑞制藥,批號:07122821);胎牛血清 (北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所,批號:XA070621HY);DG5033A酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司生產(chǎn)); CO2培養(yǎng)箱 (Thermo Forma公司);DY-1001S型DNA電泳儀 (南京大學(xué)儀器廠);JD801凝膠電泳圖象分析儀(南京捷達(dá)公司)。

2 方法

2.1 望江南總蒽醌苷的制備

望江南干燥莖(本實驗室種植)粉碎機粉碎,加10～15倍體積冷水,煮沸 20 min,過濾取上清,濾渣加水再重復(fù)煮兩次,收集三次濾液,此即為提取母液[2]。母液經(jīng)大孔樹脂層析,酒精洗脫,濃縮除去酒精,離心得清液即為望江南總蒽醌苷樣品[3]。

2.2 細(xì)胞體外增殖分析

2.2.1 望江南總蒽醌苷對肝癌細(xì)胞(HepS)體外增殖的抑制作用

無菌條件下取接種 7～10 d的 HepS瘤源小鼠的腹水,無血清 RP M I-1640培養(yǎng)基洗滌兩次,用含10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基配制成細(xì)胞濃度為 1×106/mL的細(xì)胞懸液,向 96孔板每孔加入80μL,設(shè)一空白對照孔不加細(xì)胞懸液。每個試驗組設(shè) 3～5個復(fù)孔 (蒽醌苷的終濃度分別為:1.5625、3.1250、6.25、9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、25μg/mL),另設(shè)無藥物的陰性對照組,再設(shè)一孔為各濃度樣品的無細(xì)胞組。培養(yǎng)板置于 37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h,加入 5 mg/mL的MTT8.5 μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,加入 20%的 SDS 40μL/孔,次日于酶標(biāo)儀上,490 nm下測OD值。做三次重復(fù),每組的復(fù)孔取均值,并計算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率 =[1-(試驗組 -無細(xì)胞組)/陰性對照組]×100%

2.2.2 望江南總蒽醌苷對肺癌細(xì)胞(A549)體外增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的細(xì)胞株配制成細(xì)胞濃度為 1× 105/mL的細(xì)胞懸液,加入到 96孔板中,每孔 80μL,設(shè)一空白對照孔不加細(xì)胞懸液。試驗組加不同濃度的蒽醌苷 80μL,每個試驗組設(shè) 3～5個復(fù)孔[4],根據(jù)預(yù)試驗設(shè)置試驗組蒽醌苷的終濃度分別為:6.25、9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、25μg/mL。另設(shè)無藥物的陰性對照組,再設(shè)一孔為各樣品濃度的無細(xì)胞組。以下操作同 2.2.1.

2.2.3 望江南總蒽醌苷對小鼠肉瘤 (S180)腹水型腫瘤細(xì)胞的體外增殖的抑制作用

小鼠肉瘤 S180腹水型腫瘤細(xì)胞株經(jīng)小鼠腹腔傳代,無菌抽取腹水瘤細(xì)胞,置于含 15%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時,配制成濃度為 5× 105/mL細(xì)胞懸液,接種于兩塊 96孔培養(yǎng)板上,每孔80μL設(shè)一空白對照孔不加細(xì)胞懸液,試驗組加不同濃度的望江南總蒽醌苷 80μL,每個試驗組設(shè) 6個復(fù)孔。試驗組望江南總蒽醌苷的終濃度分別為: 6.25、9.375、12.5μg/mL,另設(shè)無藥物的陰性對照組,再設(shè)一孔為各樣品濃度的無細(xì)胞組。一塊板培養(yǎng) 24 h和另一塊培養(yǎng) 48 h,以下操作同 2.2.1。

2.2.4 望江南總蒽醌苷對人正常肝細(xì)胞 (L-02)體外增殖的抑制作用

復(fù)蘇凍存的L-02細(xì)胞后,以含 10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代,取第三代對數(shù)生長期的細(xì)胞,配制成細(xì)胞濃度為 1×105/mL的細(xì)胞懸液,接種于 96孔板上,以下操作同 2.2.1。

2.3 望江南總蒽醌苷體內(nèi)抗腫瘤作用

HepS細(xì)胞株小鼠腹腔內(nèi)傳代,5～7 d傳代一次,傳代三次后,無菌條件下抽取腹水,加無菌生理鹽水洗滌離心,800 r/min離心 5 min,如此洗滌 3次,調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×107/mL,臺盼藍(lán)染色法檢測存活率≥95%,用無菌注射器抽取細(xì)胞懸液皮下注射于小鼠左后肢腋下,每只鼠接種 0.2 mL。接種 24 h后將試驗動物隨機分成五組,分別為模型組,陽性對照組及高、中、低三個劑量給藥組。每組六只,雌雄各半。模型組腹腔注射生理鹽水,陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺,劑量為 20 mg/kg·d,給藥組腹腔注射的劑量分別為 0.4、0.2、0.1 mg/kg·d,每天注射前稱體重;連續(xù)注射 12 d[6]。于末次注射后 1 h,稱鼠體重,頸椎脫臼處死小鼠。完整剝離瘤塊,稱重;解剖小鼠,取出脾臟和胸腺,稱重。計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

公式:抑瘤率 (%)=(模型組平均瘤重 -給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重 ×100

胸腺指數(shù)脾指數(shù) =脾臟重量/小鼠體重(mg/g)

胸腺指數(shù) =胸腺重量/小鼠體重(mg/g)

2.4 DNA凝膠電泳法測定望江南總蒽醌苷對肝癌細(xì)胞 HepS凋亡的影響

取 HepS肝癌腫瘤小鼠腹腔液,加入含 10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基,配制成細(xì)胞懸液,取懸液加入 24孔板中,0.5 mL/孔,并分成五組:空白對照組、CSAG-20μg/mL組、CSAG-30μg/mL組、CSAG-40μg/mL組、CSAG-50μg/mL組。分別加入0.5 mL RPM I1640、CSAG-20μg/mL、CSAG-30μg/ mL、CSAG-40μg/mL、CSAG-50μg/mL置于 37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h,取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞 1.5 mL,1500 r/min離心 4 min,棄上清,加入 1 mL PBS緩沖液懸浮細(xì)胞,1500 r/min離心 4 min,棄上清,加入 40μL 5 mol/L的 KI,振蕩 30 s,加 100 μL生理鹽水混勻,加苯酚/氯仿/異戊醇 (25∶24∶1)和苯酚/氯仿(1∶1)各抽提一次,所加的量與管中液體體積相同。小心地吸取上層水相至新管,加 0.1倍體積 3 mol/L醋酸鈉和 2.5倍體積的無水冷乙醇,上下倒置混勻,置于-20℃沉淀 0.5 h;取出于 4℃13000 r/min條件下離心 10 min,將沉淀溶于 TE緩沖液中,取各組DNA溶液 16μL,分別與 4μL上樣緩沖液混勻后電泳[7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 望江南總蒽醌苷的體外抗腫瘤活性

望江南總蒽醌苷對體外培養(yǎng)的 HepS、A549、S180細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用 (表 1～3);在總蒽醌濃度 ＜9.3750μg/mL時,促進(jìn)人正常細(xì)胞的增殖,濃度≥9.3750μg/mL時,抑制人正常細(xì)胞的增殖,江南總蒽醌苷達(dá)到一定濃度后對細(xì)胞產(chǎn)生毒性(表 4)。

表 1 望江南總蒽醌苷對鼠肝癌 HepS細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=12)Table 1 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s,n=12)

表 1 望江南總蒽醌苷對鼠肝癌 HepS細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=12)Table 1 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s,n=12)

注:與對照組性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0.001.

組別Group藥物濃度Drug concentration (μg/mL)平均A值A(chǔ)verage A抑制率Inhibition ratio(%)對照組 Control group 0.79±0.0781試驗組 Experimental group 1.5625 0.08±0.012190.00 3.1250 0.07±0.023191.25 6.2500 0.03±0.000196.20 9.3750 0.06±0.015192.50 12.5000 0.05±0.021193.75 15.6250 0.05±0.038193.75 18.7500 0.04±0.025195.00 21.8750 0.04±0.038195.00 25.0000 0.00±0.0001100.00

表 2 望江南總蒽醌苷對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=12)Table 2 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of human lung cancer cells A549(±s,n=12)

表 2 望江南總蒽醌苷對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響(x±s,n=12)Table 2 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of human lung cancer cells A549(±s,n=12)

注:與對照組性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0.001.

組別Group藥物濃度Drug concentration (μg/mL)平均A值A(chǔ)verage A抑制率Inhibition ratio(%)對照組 Control group 0.84±0.103試驗組 Experimental group 6.2500 0.50±0.0501 41.18 9.3750 0.23±0.0051 72.94 12.5000 0.03±0.0201 96.47 15.6250 0.02±0.0251 97.65 18.7500 0.01±0.0201 98.82 21.8750 0.00±0.0001 100.00 25.0000 0.00±0.0001 100.00

表 3 望江南總蒽醌苷對小鼠肉瘤 S180腹水型腫瘤細(xì)胞增殖的影響 (±s,n=12)Table 3 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of S180 mouse sarcoma asides tumor cells(±s,n=12)

表 3 望江南總蒽醌苷對小鼠肉瘤 S180腹水型腫瘤細(xì)胞增殖的影響 (±s,n=12)Table 3 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of S180 mouse sarcoma asides tumor cells(±s,n=12)

注:與對照組性比:1P＜0.05,2P＜0.005。Note:vs control group:1P＜0.05,2P＜0.005.

組別Group藥物濃度Drug concentration (μg/mL)平均A值A(chǔ)verage A抑制率Inhibition ratio(%)對照組Ⅰ(24 h) 1.20±0.113試驗組Ⅰ(24 h) 6.2500 1.03±0.127 14.16 9.3750 0.29±0.028275.83 12.5000 0.04±0.023196.67對照組Ⅱ(48h) 0.84±0.047試驗組Ⅱ(48h) 6.2500 0.93±0.000 7.14 9.3750 0.07±0.000291.67 12.5000 0.06±0.017294.64

表 4 望江南總蒽醌苷對人正常肝細(xì)胞 L-02細(xì)胞增殖的影響(±s,n=12)Table 4 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on human normal liver cell L-02 proliferation (±s,n=12)

表 4 望江南總蒽醌苷對人正常肝細(xì)胞 L-02細(xì)胞增殖的影響(±s,n=12)Table 4 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on human normal liver cell L-02 proliferation (±s,n=12)

組別Group藥物濃度Drug concentration (μg/mL)平均A值A(chǔ)verage A抑制率Inhibition ratio(%)對照組 Control group 0.98±0.053試驗組 Experimental group 1.5625 1.23±0.0001-25.51 3.1250 1.29±0.0001-31.63

注:與對照組性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0. 001.

3.2 望江南總蒽醌苷對 HepS實體瘤生長的抑制作用

實驗結(jié)果表明,望江南總蒽醌苷對實體瘤小鼠的瘤重有抑制作用 (表 5),能提高脾指數(shù)和胸腺指數(shù)(表 6),抑制腫瘤生長的同時可以保護(hù)小鼠的免疫器官,與模型組相比差異有顯著性。

表 5 望江南總蒽醌苷對荷瘤小鼠瘤重的影響 (±s,n= 12)Table 5 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on tumorweight of tumor-bearingmice(±s,n=12)

表 5 望江南總蒽醌苷對荷瘤小鼠瘤重的影響 (±s,n= 12)Table 5 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on tumorweight of tumor-bearingmice(±s,n=12)

注:與模型組相比:1P＜0.001,2P＜0.005。Note:vsmodle group:1P＜0.001,2P＜0.005。

表 6 望江南總蒽醌苷對荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s,n=12)Table 6 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on spleen index and thymus index of tumorbearingmice(±s,n=12)

表 6 望江南總蒽醌苷對荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(±s,n=12)Table 6 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on spleen index and thymus index of tumorbearingmice(±s,n=12)

注:與陽性對照組相比:1P＜0.05,2P＜0.005。Note:vs positive group:1P＜0.05,2P＜0.005.

組別Group劑量Dose (mg/kg·d)脾指數(shù)Spleen index (mg/g)胸腺指數(shù)Thymus index (mg/g)模型組 6.56±0.295 2.85±0.307 CTX組 20 4.87±0.083 1.50±0.143高劑量組 0.4 7.28±0.34721.75±0.1141中劑量 0.2 7.07±0.58222.18±0.0602低劑量組 0.1 7.17±0.71722.28±0.3922

3.3 DNA凝膠電泳法測定 CSAG對 HepS肝癌細(xì)胞凋亡的影響

實驗結(jié)果表明(圖 1),25μg/mL沒有小分子量的DAN片段,大部分細(xì)胞直接壞死;其他四組與空白對照組相比,有較多的小分子 DNA條帶且形成“Ladder”,大分子量 DNA量較少,說明細(xì)胞內(nèi)的大部分DNA已降解成分子量為核小體整數(shù)倍的DNA梯形片段,而對照組為連續(xù)性DNA碎片。結(jié)果表明四個低劑量的望江南總蒽醌苷對 HepS的凋亡有顯著的促進(jìn)作用。

圖1 DNA凝膠電泳圖Fig.1 Map ofDNA agarose gel electrophoresis

4 討論

體外實驗表明,望江南總蒽醌苷對HepS、A549、S180的增殖具有顯著的抑制作用;體內(nèi)抑瘤實驗表明,望江南總蒽醌苷對小鼠 HepS肝癌有明顯的抑制作用,且能抑制腫瘤生長,提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),增強免疫功能,其增強免疫功能是望江南抗腫瘤的機制之一。DNA凝膠電泳法和結(jié)果說明,望江南總蒽醌苷抑制 HepS細(xì)胞增殖的機制可能是,在低濃度時引起細(xì)胞凋亡,高濃度時細(xì)胞毒作用直接毒殺細(xì)胞。

以上實驗說明望江南總蒽醌苷在體內(nèi)外均具有顯著的抗腫瘤活性,其可能機制為提高免疫力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實驗只是一個初步研究,需進(jìn)一步探明望江南總蒽醌苷抗腫瘤的作用靶點,為合理開發(fā)利用望江南提供依據(jù)。

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Study on Anti-tumor Effects of Total Anthraquinone Glycosides from Coffee Senna

L I Yue-ling,ZHANG Tai-ping,PENG Shi-ming,ZHANG He-yun＊
State Key Laboratory of Phar m aceutical B iotechnology,School of Life Sciences,Nanjing University,Nanjing 210093,China

To study anti-tumor effect of anthraquinone glycosides from the tuber of Coffee Senna(CSAG)and itsmechanis m of action.The effects of CSAG on proliferation of human lung cancer cellsA549,S180 mouse sarcoma ascites tumor cells,mouse hepatoma cells HepS and human normal liver cellsL-02 was detected byMTT colorimetric assay;HepS solid tumormouse modelwasmade by subcutaneous injection of logarithmic phase of HepS cells.After medications for 12 days,the effect of CSAG at different dose(0.4,0.2,0.1 mg/kg·d)on inhibition rate of tumorweight,thymus index and spleen indexwas detected.The result is thatCSAG can inhibit the proliferation of these tumor cells,and also can significantly inhibited the growth of the tumorof tumor-bearingmice,increase thymus index and spleen index at the same time. So CSAG have significantly anti-tumor effects.The mechanis m of anti-tumor effects of CSAGmight be related to the increased immunity function ofmice and induced apoptosis.

total anthraquinone glycosides from Coffee Senna;HepS;anti-tumor;immunity;apoptposis

R285;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0701-05

2009-06-29 接受日期:2009-10-23

＊通訊作者 Tel:86-25-83592335;E-mail:cflab@126.com