趙云生,萬(wàn)德光,裴 瑾,李占林,田洪嶺,任志萍

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 610075;2山西省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所;3山西省汾陽(yáng)市疾控中心,汾陽(yáng) 032200

遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志酸含量影響因素初探

趙云生1,2,萬(wàn)德光1＊,裴 瑾1,李占林2,田洪嶺2,任志萍3

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 610075;2山西省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所;3山西省汾陽(yáng)市疾控中心,汾陽(yáng) 032200

采用 HPLC法測(cè)定遠(yuǎn)志藥材、根心、遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量,考察產(chǎn)地、緯度、海拔、生長(zhǎng)期、采收期以及遠(yuǎn)志不同生長(zhǎng)部位對(duì)遠(yuǎn)志酸含量的影響,探討遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志酸含量影響因素。結(jié)果表明:產(chǎn)地、采收期以及遠(yuǎn)志不同生長(zhǎng)部位對(duì)遠(yuǎn)志酸含量的影響達(dá)極顯著水平,緯度與海拔對(duì)遠(yuǎn)志酸含量具有一定影響。遠(yuǎn)志生產(chǎn)應(yīng)選擇適宜產(chǎn)區(qū),適時(shí)采收,遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaW illd根心與卵葉遠(yuǎn)志P.sibiricalL.葉中含有一定的遠(yuǎn)志酸,具有開發(fā)價(jià)值。

遠(yuǎn)志;遠(yuǎn)志酸;影響因素;HPLC

遠(yuǎn)志始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有安神益智,祛痰,消腫的作用,是我國(guó)傳統(tǒng)出口藥材,也是國(guó)家 42種重點(diǎn)保護(hù)的三級(jí)野生品種之一,《中國(guó)藥典》2005年版收載遠(yuǎn)志基源為遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaW illd和卵葉遠(yuǎn)志P.sibiricalL.,以遠(yuǎn)志酸含量作為遠(yuǎn)志質(zhì)量控制的指標(biāo)[1]。

本實(shí)驗(yàn)研究了遠(yuǎn)志藥材 (去心根皮)、根心、遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量變化,對(duì)遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志酸積累影響因素進(jìn)行了探討,以期更好地開發(fā)和利用我國(guó)遠(yuǎn)志資源,為遠(yuǎn)志規(guī)范化種植及新藥源的擴(kuò)大提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安公司 Summit HPLC,Detector UVD 170U, Column Thermostat TCC-100;浙江大學(xué) N2000色譜數(shù)據(jù)工作站,索氏提取器。

1.2 試藥

對(duì)照品:遠(yuǎn)志酸 (成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。

樣品:遠(yuǎn)志藥材 21份 (野生樣品 16份,栽培樣品 5份),根心 5份,葉 11份。野生樣品均采自2007年 10～11月,分布于向陽(yáng)的山中坡地或平原深溝坡地,伴生植物低矮,大多不高于 40 cm,與遠(yuǎn)志雜生,土層深厚,砂質(zhì)或略黏壤土。栽培遠(yuǎn)志種植于山西省農(nóng)科院經(jīng)作所試驗(yàn)田。

所有樣品由成都中醫(yī)藥大學(xué)萬(wàn)德光教授鑒定為遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld和卵葉遠(yuǎn)志P.sibiricalL。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

采用 18烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 Welchrom C18(5μm,250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸溶液 (70∶30);檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm;理論塔板系數(shù)以遠(yuǎn)志酸計(jì) 7190;流速:lmL/min;柱溫 30℃;進(jìn)樣量:遠(yuǎn)志藥材 5μL、根心或葉 20μL。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖 1。

圖 1 遠(yuǎn)志標(biāo)準(zhǔn)品(上)與樣品(下)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard(above)and sample (low)

2.2 供試品溶液的制備

取 60℃下干燥至恒重的遠(yuǎn)志粉末 (4號(hào)篩)約1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加甲醇 100 mL,回流 5 h,減壓回收甲醇至干,殘?jiān)?10%稀鹽酸 20 mL,沸水浴回流 2 h,冷卻,過(guò)濾并用蒸餾水洗滌沉淀至中性,用甲醇溶解沉淀并定容至 10 mL,即得供試品溶液[2,3]。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取遠(yuǎn)志酸對(duì)照品 3.74 mg,置 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得 (每 1 mL含遠(yuǎn)志酸 374μg)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取對(duì)照品溶液(0.374 mg/mL)1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品質(zhì)量 (X)為橫坐標(biāo),峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)回歸處理,得回歸方程:Y=3.8663X-0.3909,r=0.9999,遠(yuǎn)志酸在0.374～11.22μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一遠(yuǎn)志供試品溶液,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6次,每次 5μL,測(cè)定峰面積,RSD= 0.38%,表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一遠(yuǎn)志藥材供試液,室溫放置,在上述色譜條件下,分別在 0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣 1次,每次 5 μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算遠(yuǎn)志酸含量,共考察24 h,RSD =0.31%,表明樣品溶液在至少 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品 6份,分別按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定遠(yuǎn)志酸含量,RSD=2.87%,表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的遠(yuǎn)志藥材粉末各 0.5 g,共6份,按供試品溶液制備方法制得供試液,精密加入遠(yuǎn)志酸對(duì)照品溶液(濃度為 0.374 mg/mL)1 mL,按上述色譜條件測(cè)定遠(yuǎn)志酸含量,計(jì)算回收率,結(jié)果遠(yuǎn)志酸平均回收率為 98.45%,RSD=2.80%(表 1)。

表 1 回收率試驗(yàn)(n=6)Table 1 Recovery test(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

分別取制備好的樣品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣,測(cè)定,記錄遠(yuǎn)志酸峰面積,計(jì)算遠(yuǎn)志酸含量。

3 遠(yuǎn)志中遠(yuǎn)志酸含量影響因素探析

采用 Excel計(jì)算各樣品遠(yuǎn)志酸含量,采用SPSS13.0進(jìn)行 F測(cè)驗(yàn),比較各樣品間遠(yuǎn)志酸含量差異,試驗(yàn)結(jié)果見表 2～4。

3.1 產(chǎn)地對(duì)遠(yuǎn)志酸含量的影響

對(duì)山西、陜西、甘肅、四川四省 16份藥材遠(yuǎn)志酸含量測(cè)定結(jié)果表明 (表 2),不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志酸含量差異達(dá)極顯著水平 (P=0.01,n=3),產(chǎn)地對(duì)遠(yuǎn)志次生代謝產(chǎn)物遠(yuǎn)志酸含量影響顯著。

3.2 緯度與海拔對(duì)遠(yuǎn)志酸含量的影響

海拔高度(422～2309 m)與緯度 (31°41′～39° 31′)對(duì)遠(yuǎn)志酸含量具有一定影響 (圖 2)。海拔高度在 422～698 m時(shí)遠(yuǎn)志酸含量較高,均大于 1%,其余海拔高度遠(yuǎn)志酸含量一般不大于 1%。緯度對(duì)遠(yuǎn)志酸積累的影響呈波浪形變化,緯度 34°09′～35° 52′、37°15′～39°31′,隨著緯度的增高,遠(yuǎn)志酸含量呈下降趨勢(shì),在緯度 35°52′～36°50′,遠(yuǎn)志酸含量呈上升趨勢(shì),總體上來(lái)說(shuō)遠(yuǎn)志酸含量在緯度 34°09′～35°20′區(qū)間含量較高,大于 1%,該緯度區(qū)間山西聞喜、陜西西安等地也是遠(yuǎn)志主產(chǎn)區(qū),可能與這些地區(qū)夏季高溫干燥的氣候環(huán)境有利于遠(yuǎn)志有效物質(zhì)群的積累有關(guān),可以選擇這一區(qū)域建立遠(yuǎn)志 GAP生產(chǎn)基地,遠(yuǎn)志酸含量在其余緯度區(qū)間一般不高于 1%。

遠(yuǎn)志酸是遠(yuǎn)志皂苷的水解產(chǎn)物,不同海拔地區(qū)遠(yuǎn)志酸含量存在一定差異,變化幅度 0.45%～1.59%,平均含量 0.86%。海拔高度在 422～698 m的地區(qū)遠(yuǎn)志酸含量明顯高于其余海拔地區(qū),隨著海拔升高,遠(yuǎn)志酸含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)。

遠(yuǎn)志酸的積累通常是在一定的海拔高度與緯度下共同作用的結(jié)果,將二者結(jié)合起來(lái)分析,能夠進(jìn)一步接近遠(yuǎn)志酸積累的實(shí)際狀況,為此將遠(yuǎn)志分布的緯度與海拔高度分別進(jìn)行加權(quán)換算,以最高緯度39°31′與最高海拔高度 2309 m的加權(quán)數(shù)均為 1,通過(guò)下式進(jìn)行換算:某遠(yuǎn)志加權(quán)數(shù) =該遠(yuǎn)志緯度/39° 55′+該遠(yuǎn)志海拔高度 /2309

以遠(yuǎn)志加權(quán)數(shù)為橫坐標(biāo),遠(yuǎn)志酸含量為縱坐標(biāo),繪制散點(diǎn)圖 (圖 2),緯度與海拔加權(quán)數(shù)大于 1.05時(shí),隨著加權(quán)數(shù)的增加,遠(yuǎn)志酸含量具有逐漸降低的趨勢(shì),緯度與海拔加權(quán)數(shù)在 1.05～1.20、1.42時(shí)遠(yuǎn)志酸含量均較高,大于 1%。

3.3 生長(zhǎng)期與采收月份對(duì)遠(yuǎn)志酸含量變化的影響

該試驗(yàn)以栽培遠(yuǎn)志“汾遠(yuǎn) 1號(hào)”為試驗(yàn)材料,在大田栽培條件下進(jìn)行試驗(yàn),方差分析表明,不同生長(zhǎng)時(shí)間與采收月份,遠(yuǎn)志酸含量達(dá)極顯著差異 (P= 0.01,n=3),7月份采收遠(yuǎn)志的遠(yuǎn)志酸含量極顯著高于其它月份采收的遠(yuǎn)志,由表 3可知,遠(yuǎn)志在 7、8、9月份采收,遠(yuǎn)志酸含量均顯著高于 10、11月份采收的遠(yuǎn)志,在 10月份與 11月份采收遠(yuǎn)志,遠(yuǎn)志酸含量相差不顯著 (P=0.05,n=3)。

由遠(yuǎn)志不同生長(zhǎng)時(shí)間可知,生長(zhǎng) 2個(gè)月遠(yuǎn)志與生長(zhǎng) 8個(gè)月遠(yuǎn)志遠(yuǎn)志酸含量差異不顯著,說(shuō)明遠(yuǎn)志酸積累與遠(yuǎn)志生長(zhǎng)時(shí)間可能關(guān)系不大,而與遠(yuǎn)志收獲時(shí)期關(guān)系密切,由于“汾遠(yuǎn) 1號(hào)”為系選材料,親緣關(guān)系一致,生長(zhǎng)于同一塊試驗(yàn)田中,遠(yuǎn)志生長(zhǎng)環(huán)境比較一致,因而遠(yuǎn)志酸含量差異只能由兩個(gè)因素造成,一為遠(yuǎn)志生長(zhǎng)發(fā)育階段,二為遠(yuǎn)志采收時(shí)期,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,遠(yuǎn)志酸生物積累可能與遠(yuǎn)志收獲時(shí)期有關(guān),而與遠(yuǎn)志生長(zhǎng)發(fā)育階段關(guān)系并不密切。7月份采收遠(yuǎn)志酸含量較高,說(shuō)明生產(chǎn)地在 6～7月份的高溫干燥環(huán)境能夠刺激遠(yuǎn)志酸生物合成的各種關(guān)鍵酶,從而提高遠(yuǎn)志酸的生物積累,同一份試驗(yàn)材料在 7月份采收時(shí)遠(yuǎn)志酸含量顯著高于 10月份遠(yuǎn)志,說(shuō)明外界環(huán)境條件改變時(shí),已經(jīng)合成的遠(yuǎn)志酸能夠自行分解,可見在進(jìn)行遠(yuǎn)志規(guī)?；a(chǎn)時(shí),選擇適宜的采收時(shí)期比生長(zhǎng)時(shí)期更為重要,采收期對(duì)遠(yuǎn)志藥材質(zhì)量影響較大。

表 3 不同生長(zhǎng)期與采收時(shí)間藥材(去心)與根心遠(yuǎn)志酸含量(n=3)Table 3 Content of polygalacic acid in different vegetative period and harvest time(n=3)

3.4 遠(yuǎn)志根心中遠(yuǎn)志酸含量變化

遠(yuǎn)志根心中含有一定量的遠(yuǎn)志酸 (表 3),以 7、10兩個(gè)月份采收的遠(yuǎn)志根心,遠(yuǎn)志酸含量較高,其余月份相差不大,遠(yuǎn)志根心中遠(yuǎn)志酸積累模式與遠(yuǎn)志藥材(遠(yuǎn)志根皮)有所區(qū)別,遠(yuǎn)志根心在 8～10月份遠(yuǎn)志酸含量逐漸增加,與遠(yuǎn)志藥材中遠(yuǎn)志酸積累模式正好相反,遠(yuǎn)志根心與遠(yuǎn)志藥材遠(yuǎn)志酸積累模式是否具有相關(guān)性,有待進(jìn)一步研究。遠(yuǎn)志根心與遠(yuǎn)志藥材在 7月份采收時(shí)遠(yuǎn)志酸含量均較高,說(shuō)明產(chǎn)區(qū) 6～7月份的生態(tài)因子有利于遠(yuǎn)志酸生物合成。

3.5 遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量變化

對(duì)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量測(cè)定表明 (表4),不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志 (Polygala tenuifoliaW illd)葉中遠(yuǎn)志酸含量均非常低,幾乎不含有遠(yuǎn)志酸,但四川荗縣與九龍山卵葉遠(yuǎn)志葉 (P.sibiricalL.)中遠(yuǎn)志酸含量較高,達(dá) 0.4%以上,具有一定的開發(fā)價(jià)值。遠(yuǎn)志與卵葉遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量差異說(shuō)明二者種間的遺傳差異影響到了葉中化學(xué)成分的生物合成。

表 4 遠(yuǎn)志葉中遠(yuǎn)志酸含量(n=3)Table 4 Content of polygalacic acid in leaves of P.tenuifolia orP.sibiricain different habitats(n=3)

4 討論與小結(jié)

4.1 遠(yuǎn)志酸含量積累受產(chǎn)地影響顯著,生產(chǎn)中對(duì)遠(yuǎn)志產(chǎn)區(qū)的強(qiáng)調(diào)十分必要。遠(yuǎn)志酸積累受采收期影響較大,生長(zhǎng)期對(duì)遠(yuǎn)志酸積累影響可能并不大。

4.2 遠(yuǎn)志不同生長(zhǎng)部位對(duì)遠(yuǎn)志酸含量影響極大,遠(yuǎn)志藥材(去心)遠(yuǎn)志酸含量遠(yuǎn)大于遠(yuǎn)志根心與遠(yuǎn)志葉,遠(yuǎn)志酸能在遠(yuǎn)志根心中產(chǎn)生一定積累,在進(jìn)行遠(yuǎn)志提取物生產(chǎn)時(shí),可以將遠(yuǎn)志根心作為原料使用。遠(yuǎn)志 (Polygala tenuifoliaW illd)葉中遠(yuǎn)志酸積累非常少,但卵葉遠(yuǎn)志葉 (P.sibiricalL.)中遠(yuǎn)志酸含量稍高。

4.3 海拔高度與緯度對(duì)遠(yuǎn)志酸含量積累的影響主要是通過(guò)影響溫度與光照實(shí)現(xiàn),由于遠(yuǎn)志酸積累是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,受多種因素影響,除海拔與緯度外,還受產(chǎn)區(qū)海陸位置、地形、季風(fēng)、土壤以及遠(yuǎn)志遺傳特征等等因素的影響,因而進(jìn)行遠(yuǎn)志生產(chǎn)應(yīng)多種因素綜合考慮。

4.4 遠(yuǎn)志根心與遠(yuǎn)志藥材在 8～10月份遠(yuǎn)志酸積累趨勢(shì)相反,二者有無(wú)相關(guān)性,有待進(jìn)一步研究。

1 China Phar macopoeia.First Part(中國(guó)藥典,一部),2005. 107-108.

2 Liu YP(劉友平),Wan DG(萬(wàn)德光),Song Y(宋英).Determination of dehydroxypresenegenin inPolygalae teuuifoliaby HPLC.Chin Tradit Herb D rugs(中草藥),2001,32:786-787.

3 Liu YP(劉友平),Wan DG(萬(wàn)德光),Liu T(劉濤),et al. The contentof total saponinsofPolygalae teuuifoliafrom different habitats was determined by spectrophotometry.J Chengdu Univ TCM(成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)),2000,23(2): 46-47.

Study on Some Influence Factors of Polygalacic Acid Content inPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.

ZHAO Yun-sheng1,2,WAN De-guang1＊,PEIJin1,L I Zhan-lin2,T IAN Hong-ling2

1College of Phar macy,Chengdu University of Traditional ChineseM edicine,Chengdu 610075,China;2Industrial Crop Research Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences;3Fenyang Centers forD isease Prevention&Control,Fenyang 032200,China

The polygalacic acid was deter mined to study its influence factors in medicinalmaterials,root xylem and leaves ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.by HPLC,and the factorswere investigated about the growing area,latitude,elevation,the period of growth or harvesting and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.. The results showed that the difference of growing area,harvesting period and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.is significant at the 0.01 level,latitude and elevation has some impact.The geo-authentic producing areas should be chosen in Radix Polygalae production,and it should be harvested timely.The root xylem ofPolygala tenuifoliaW illd and the leaves ofP.sibiricalL.have some polygalacic acid and development value.

Polygala tenuifoliaW illd;P.sibiricalL.;polygalacic acid;influence factors;HPLC

R917;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0634-05

2008-09-16 接受日期:2009-02-09

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006031080-1);山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007011091)

＊通訊作者 Tel:86-28-87779801;E-mail:wdg@cdutcm.edu.cn