楊笛笑,李麒麟,張國林,王 飛

中國科學(xué)院成都生物研究所,成都 610041

齊墩果醇-龍膽三糖苷雌激素樣作用及其對肝癌 HepG2細(xì)胞增殖的影響

楊笛笑,李麒麟,張國林,王 飛＊

中國科學(xué)院成都生物研究所,成都 610041

肝癌目前已經(jīng)成為世界第三大癌癥,臨床數(shù)據(jù)顯示雌激素及其受體與肝癌關(guān)系密切。苯并呋喃類化合物有報(bào)道具有雌激素樣作用。所以,作為苯并呋喃的一種,研究齊墩果醇-龍膽三糖苷雌激素樣作用及其對HepG2細(xì)胞增殖的影響顯得尤為重要。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有 ERE(雌激素作用元件)報(bào)告基因的 HepG2中,齊墩果醇-龍膽三糖苷顯示了同 17β-雌二醇一樣激活 ERE報(bào)告基因的作用;而在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有 CRE(cAMP作用元件)報(bào)告基因的 HepG2中,齊墩果醇-龍膽三糖苷也顯示了升高 cAMP濃度的作用,進(jìn)一步提示齊墩果醇-龍膽三糖苷的類雌激素樣作用。齊墩果醇-龍膽三糖苷對 HepG2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,30μmol/L濃度時(shí)該化合物的雌激素樣作用同 17β-雌二醇一樣有相似的促 HepG2細(xì)胞增殖作用。

齊墩果醇-龍膽三糖苷;雌激素樣作用;HepG2細(xì)胞;ERE;CRE

現(xiàn)在肝癌已經(jīng)成為世界第三大癌癥,臨床數(shù)據(jù)顯示雌激素及其受體與肝癌關(guān)系密切,大量資料證實(shí)外源性的雌激素長期刺激可導(dǎo)致肝細(xì)胞腫瘤發(fā)病率的升高[1,2]。雖然雌激素對肝癌影響的準(zhǔn)確機(jī)制至今仍無定論,但是普遍觀點(diǎn)認(rèn)為雌激素通過其經(jīng)典信號途徑與核雌激素受體結(jié)合,促進(jìn)肝細(xì)胞的基因發(fā)生非整合性改變從而導(dǎo)致肝癌[3]并且促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。第二信使 cAMP是細(xì)胞內(nèi)的信息分子,在細(xì)胞活化、增殖及凋亡過程中有十分重要的作用。雌激素能通過非經(jīng)典途徑,與細(xì)胞膜的雌激素受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的 GPR30結(jié)合后增加 cAMP的濃度,是雌激素非經(jīng)典信號激活的一個(gè)重要標(biāo)志[4]。

實(shí)驗(yàn)室前期研究 (專利申請?zhí)?200510020477. 7)發(fā)現(xiàn),瓦山安息香種植物 (Styrax perkinsiae,Rehd)果實(shí)中的乙醇提取物具有促雌激素生成作用[5]。其主要成分 2-芳基苯并呋喃類化合物常見活性報(bào)道為體外抗菌及一定程度的細(xì)胞毒性[6-9],目前也有報(bào)道其作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑有雌激素樣作用[10,11]。齊墩果醇-龍膽三糖苷作為從瓦山安息香果實(shí)中的乙醇提取物中分離出來的一種 2-芳基苯并呋喃類化合物,相對報(bào)道較少。因此,評價(jià)齊墩果醇-龍膽三糖苷類雌激素作用及其對肝癌細(xì)胞的增殖影響,對后續(xù)研究齊墩果醇-龍膽三糖苷類雌激素作用機(jī)制顯得尤為重要。

本試驗(yàn)從齊墩果醇-龍膽三糖苷是否有類雌激素作用著手,討論該化合物對肝癌細(xì)胞 HepG2增殖的影響,并說明類雌激素作用與 HepG2增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

齊墩果醇-龍膽三糖苷為實(shí)驗(yàn)室前期研究中從瓦山安息香 (Styrax perkinsiaeRehd)種子氯仿和正丁醇相中分離得到的單體[12]。

HepG2肝癌細(xì)胞株購自 ATCC,pERE/Luc (Stratagene,Inc);SunBioTMAm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑 (上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司 );Lipofectamine2000轉(zhuǎn)化試劑盒 (Invitrogen, Inc);17β-雌二醇 (Sigma,Inc);熒光素酶檢測試劑盒(Promega,Inc)。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱 (Ther mo,Inc);化學(xué)發(fā)光檢測儀(Thermo,Inc);離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);恒溫?fù)u床 (上海智城分析儀器制造有限公司);無菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);微量移液器(Gilson,Inc)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于 RPM I1640(10%小牛血清,100 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素液)培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2條件下 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

按 2.5×105個(gè)/mL密度接種 HepG2細(xì)胞于 24孔板中,10%去內(nèi)源性激素血清的 RPM I1640培養(yǎng)基,無抗生素培養(yǎng) 24 h使細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%。

以DNA(μg)∶Lipofectamine(μL)=1∶2.5的比例,即 pERE– Luc質(zhì)粒按每孔 0.7μg pERE-Luc +0.1μg pSV-βgal比例加入 50μL OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻;pCRE– Luc質(zhì)粒按每孔 0.7μg pCRELuc+0.1μg pSV-βgal比例加入 50μL OPTI-MEM培養(yǎng)基混勻。2μL lipofectamine加入 50μL OPTIMEM培養(yǎng)基混勻,靜置 5 min,將質(zhì)粒溶液逐滴加入到 lipofectamine溶液中,靜置 0.5 h,待其形成復(fù)合物。按每孔 100μL復(fù)合物的量加入復(fù)合物至每孔400μL去內(nèi)源性激素血清的常規(guī) RPM I1640培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染 4～6 h。

1.5 齊墩果酸-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2內(nèi)雌激素作用元件的影響

轉(zhuǎn)染有pERE–Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后換去原有培養(yǎng)基,分為三組進(jìn)行試驗(yàn):空白對照組、陽性對照組 17β-雌二醇終濃度 10 nmol/L、樣品組齊墩果醇-龍膽三糖苷終濃度 30μmol/L。繼續(xù)在 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。

1.6 齊墩果酸-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2內(nèi)cAMP的影響

轉(zhuǎn)染有pCRE–Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后換去原有培養(yǎng)基,分為三組進(jìn)行試驗(yàn):空白對照組、陽性對照組 forskolin 10 nmol/L、樣品組齊墩果醇-龍膽三糖苷終濃度30μmol/L。繼續(xù)在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。

1.7 熒光素酶檢測

按照 1.5和 1.6步驟加藥 24 h后,取細(xì)胞裂解液 50μL根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒 (steady-glo luciferase assay system.Promega)說明書操作,吸取各樣品細(xì)胞裂解上清 50與 50μL luciferase assay reagent在化學(xué)發(fā)光檢測儀上定量檢測熒光素酶活性(RLU值)。

為排除由于轉(zhuǎn)染效率不同造成的報(bào)告基因RLU值差異,故在轉(zhuǎn)染時(shí)共轉(zhuǎn)內(nèi)參對照pSV-βgal,檢測βgal半乳糖苷酶活性從而將 RLU值平均到同一轉(zhuǎn)染水平。βgal半乳糖苷酶活性檢測:60μL裂解液,133μL ONPG,6μL Mg2+,400μL PBS,混合后37℃水浴至黃色出現(xiàn)。420 nm檢測 OD420。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3次每組設(shè)置三復(fù)孔,所得結(jié)果以 x ±s表示。采用 t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 齊墩果酸-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2增殖的影響

取對數(shù)生長期 HepG2細(xì)胞,按 1×105個(gè)/mL密度接種 100μL在 96孔培養(yǎng)板中,去內(nèi)源性激素血清的 RPM I164無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h。待細(xì)胞生長為單層后分別加入 17β-雌二醇和 Egonol龍膽三糖苷。以不加藥物作為空白對照,加入 17β-雌二醇終濃度 10 nmol/L作為陽性對照,齊墩果醇-龍膽三糖苷濃度梯度為 300、30、3、0.3、0.03μmol/L,繼續(xù)在 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng) 72 h。

在待測細(xì)胞上清中加入 10%細(xì)胞懸液體積的檢測試劑,在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2～6 h,培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)開始變成粉紅色后即可進(jìn)行檢測。

用全波長酶標(biāo)儀測定吸光度,濾波器波長 570nm,參考波長 600 nm,(實(shí)際吸光讀數(shù) =OD570-OD600)。重復(fù)三次試驗(yàn),細(xì)胞的增殖率按下面公式計(jì)算:增殖率(%)=[(用藥組 OD值 -空白對照組OD值)/空白對照組OD值]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果醇-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2內(nèi)雌激素作用元件的影響

圖 1為齊墩果醇-龍膽三糖苷對 HepG2細(xì)胞胞內(nèi) ERE的影響。為排除因轉(zhuǎn)染效率引起的 RLU值變化,將 pERE-Luc與 pSV-βgal一起共轉(zhuǎn)后,檢測βgal半乳糖苷酶活性,從而將 RLU值平均到同一轉(zhuǎn)染水平。

圖1 齊墩果醇-龍膽三糖苷對人HepG2細(xì)胞中 ERE的影響Fig.1 Effect of Egonol gentiotrioside on ERE in HepG2 of human

從圖 1可以看出,以空白組 RLU值為 1時(shí),陽性組相比于空白組對照組 RLU值為 3左右,差異極其顯著 (P＜0.01)?；衔稞R墩果醇-龍膽三糖苷組相較于空白對照組相對 RLU值與陽性組幾乎相同,差異極其顯著 (P＜0.01)。表明齊墩果醇-龍膽三糖苷與 17β-雌二醇一樣有作用于雌激素作用元件的作用。

圖2 齊墩果醇-龍膽三糖苷對人HepG2細(xì)胞中CRE的影響Fig.2 Effect of Egonol gentiotrioside on CRE in HepG2 of human

2.2 齊墩果醇-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2內(nèi)cAMP作用元件的影響

圖 2為齊墩果醇-龍膽三糖苷對 HepG2細(xì)胞胞內(nèi) CRE的影響。同樣按照 2.2方法將 RLU值平均到同一轉(zhuǎn)染水平。

從圖 2可以看出,以空白組 RLU值為 1時(shí),陽性組相比于空白組對照組為 2左右,差異極其顯著(P＜0.01)?；衔稞R墩果醇-龍膽三糖苷相較于空白對照組相對 RLU值為 9左右,差異極其顯著(P＜0.01),顯示了極強(qiáng)的提高 cAMP的作用。

2.3 齊墩果醇-龍膽三糖苷對肝癌細(xì)胞 HepG2增殖的影響

表1 齊墩果醇-龍膽三糖苷對HepG2細(xì)胞增殖的影響(x± )s,n=3Table 1 Effect of egonol gentiotrioside on HepG2 cell proliferation(±s,n=3)

表1 齊墩果醇-龍膽三糖苷對HepG2細(xì)胞增殖的影響(x± )s,n=3Table 1 Effect of egonol gentiotrioside on HepG2 cell proliferation(±s,n=3)

注:＊與空白對照組比較P＜0.05;＊＊與空白對照組比較P＜0.01。

組別 Group 劑量Dose 增殖率Proliferation rate(%)空白組Blank 0.00±0.00陽性組雌二醇 Estradiol 10 nmol/L 60.23±12.20＊＊齊墩果醇-龍膽三糖苷Egonol gentiotrioside 300μmol/L 15.03±2.97 30μmol/L 33.52±3.07＊3μmol/L 4.81±4.23 0.3μmol/L 2.34±1.18 0.03μmol/L 2.06±1.03

由表 1,齊墩果醇-龍膽三糖苷,在終濃度為 3、0.3、0.03μmol/L時(shí)對 HepG2細(xì)胞增殖率小于10%,t檢驗(yàn),結(jié)果無顯著性差異,說明當(dāng)齊墩果醇-龍膽三糖苷在上述終濃度下對 HepG2細(xì)胞沒有明顯促增殖作用,在 30μmol/L時(shí)達(dá)到最大增殖率33.52%,促 HepG2細(xì)胞增殖作用明顯增強(qiáng)。

3 討論

為探明齊墩果醇-龍膽三糖苷的雌激素樣作用,我們選用了 pERE-Luc和 pCRE-Luc兩種熒光素酶報(bào)告基因,從雌激素經(jīng)典信號途徑和非經(jīng)典信號途徑兩個(gè)方面來檢測齊墩果醇-龍膽三糖苷的雌激素樣作用。

雌激素經(jīng)典信號途徑:雌激素與其特異受體結(jié)合后受體發(fā)生空間構(gòu)象改變而形成二聚體,從而暴露 DNA結(jié)合區(qū)使特異DNA序列與之結(jié)合,即靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的 ERE(雌激素作用元件)與之結(jié)合,并募集輔助因子形成轉(zhuǎn)錄啟始復(fù)合物而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄[13]。雌激素致癌作用被認(rèn)為是通過雌激素受體信號途徑(經(jīng)典信號途徑介導(dǎo)),引起自發(fā)突變從而引起癌細(xì)胞的增殖[13]。我們通過 ERE報(bào)告基因來檢測樣品同雌二醇類似的與 ERE作用的現(xiàn)象。結(jié)果顯示齊墩果醇-龍膽三糖苷具有與陽性藥 17β-雌二醇幾乎相等的作用,差異極為顯著。進(jìn)一步提示該化合物有類似雌激素樣作用,并且可以激活雌激素經(jīng)典信號途徑。

在雌激素的非經(jīng)典信號途徑中,雌激素可通過細(xì)胞膜結(jié)合的雌激素受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合的GPR30活化腺苷酸環(huán)化酶 (AC)[4]。雌激素激活A(yù)C后,可見 cAMP水平增高[14]。cAMP是細(xì)胞內(nèi)的第二信使,在細(xì)胞活化、增殖及凋亡過程中有十分重要的作用。Forskolin是一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑,它提高胞內(nèi) cAMP濃度的途徑與 17β-雌二醇一致。在齊墩果醇-龍膽三糖苷對人 HepG2細(xì)胞 cAMP的影響試驗(yàn)中其相對 RLU值相較于空白對照組差異在 9倍左右,顯示了極強(qiáng)的提高 cAMP的作用。進(jìn)一步說明齊墩果醇-龍膽三糖苷在雌激素非經(jīng)典途徑上也有類雌激素作用。

雌激素對肝癌的影響雖然已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道稱與雌激素的經(jīng)典信號途徑及非經(jīng)典信號途徑有關(guān),但是其準(zhǔn)確機(jī)制至今仍無定論。Vitale Miceli等人實(shí)驗(yàn)證實(shí),雌激素對肝癌細(xì)胞有增殖作用,是通過與芳香酶活性相關(guān)的雙調(diào)蛋白信號來實(shí)現(xiàn)的。HepG2細(xì)胞是 ERα(雌激素受體α)陽性的人肝癌細(xì)胞株,能特異性地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖[13]。

在研究齊墩果醇-龍膽三糖苷的類雌激素作用對 HepG2細(xì)胞增殖影響時(shí),我們選用了Alamar-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑,避免了傳統(tǒng)MTT法因?yàn)閷?xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用從而引起的結(jié)果誤差,使數(shù)據(jù)結(jié)果更準(zhǔn)確,操作更簡便。本研究結(jié)果顯示,齊墩果醇-龍膽三糖苷能在去激素培養(yǎng)條件下對 HepG2細(xì)胞增殖有一定作用,與陽性藥 17β-雌二醇呈現(xiàn)的作用相同,表明齊墩果醇-龍膽三糖苷的類雌激素作用對 HepG2細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究齊墩果醇-龍膽三糖苷類雌激素作用及其對人肝癌細(xì)胞 HepG2增殖的影響,目前該化合物在這方面的研究尚未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示齊墩果醇-龍膽三糖苷有類雌激素作用,且該作用促進(jìn)HepG2增殖。該結(jié)論對評價(jià)該化合物作為藥物研究的安全性及實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的齊墩果醇-龍膽三糖苷類雌激素作用有重要價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)主要是從該化合物類雌激素作用方面進(jìn)行其促人肝癌細(xì)胞 HepG2增殖的研究,也主要是針對化合物在轉(zhuǎn)錄水平的研究,還不能全面揭示它促進(jìn) HepG2增殖的機(jī)制。因此,應(yīng)該通過建立其它相關(guān)模型,考察該化合物同雌激素激活的相關(guān)信號途徑中的作用。

1 Oberley TD,SlatteryAF,GonzalezA,et al.Comparative morphologic and immunohistochemical studies of estrogen plus alpha-naphthoflavone-induced liver tumors in Syrian hamsters and rats.Am J Pathol,1991,139:669-679.

2 MachishiH,Higashi S,HibasamiH.Role of activation of ornithine decarboxylase and DNA synthesis on ethynylestradiol-induced hepatocarcinogenesis.Carcinogenesis,1995,16:2965-2971.

3 Wu HW(吳洪文),BaiWK(白文坤),Wang WQ(王文奇),et al.Expression and ills implication of estradiol and estrogen receptor in primar.J Clin Hepatol(實(shí)用肝臟病雜志),2007,10(2):92-93.

4 Richard J,Pietras,DianaC,et al.Membrane-associated estrogen receptor signaling pathways in human cancers.Clin Cancer Res,2007,13:4672-4676.

5 Gao XP(高小平),Li QL(李麒麟),et al.The preparation methods and application of total benzofurans from Styrax perkinsiae,Rehd.(安息香屬植物總苯并呋喃提取物及其制備方法和應(yīng)用).CN 200510020477.2006-9-13.

6 Pauletti PM,Araújo AR,et al.nor-Lignans from the leaves ofStyrax ferrugineus(Styracaceae)with antibacterial and antifungal activity.Phytochem istry,2000,55:597-601.

7 Tsai IL,Hsieh CF,et al.Additional cytotoxic neolignans fromPersea obovatifolia.Phytochem istry,1998,48:1371-1375.

8 Tsai IL,Hsieh CF,Duh CY,et al.Cytotoxic neolignans fromPersea obovatifolia.Phytochem istry,1996,43:1261-1263.

9 Cui B,Chai H,Santisuk T,et al.Novel cytotoxic 1H-cyclopentab benzofuran lignans fromAglaia elliptica.Tetrahedron, 1997,53:17625-17632.

10 Katsanou ES,HalabalakiM,Aligiannis N,et al.Cytotoxiceffects of 2-arylbenzofuran phytoestrogens on human cancer cells:modulation by adrenal and gonadal steroids.J Steroid B iochem M ol B iol,2007,104:228-236.

11 ColliniMD,Kaufman DH,Manas ES,et al.7-Substituted 2-phenyl-benzofurans as ERb selective ligands.B ioorg M ed Chem Lett,2004:4925-4929.

12 LiQL.Studieson the bio-activities constituents of Styrax perkinsiae and Rabdosia coetsa.Chengdu:Chengdu Institute of Biology.Beijing:Chinese Academy of Sciences,PhD.2005.

13 MiceliV,Cervello M,et al.Aromatase and amphiregulin are correspondingly expressed in human liver cancer cells.Steroid Enzym es and Cancer,2009,1155:252-256.

14 Chen JQ,Yager JD.Estrogen’s effects on mitochondrial gene expression,mechanisms and potential contributions to estrogen.Carcinogenesis,2004,10:258-272.

15 Ackerman GE,Carr BR.Estrogens.Rev Endocr M etab D isord,2002,3:225-230.

Estrogen ic Activity of Egonol Gentiotrioside and Its Effect on HepG2 Cells Proliferation

YANGDi-xiao,L IQi-lin,ZHANG Guo-lin,WANG Fei＊
Chengdu Institute of B iology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China

Hepatocellular carcinoma is the third cause of cancer death worldwide,and clinical study indicates that estrogen and its receptors are involved in the hepatocellular carcigenesis.It is reported that the benzofuran has estrogenic activity.So,it’s important to evaluate the effect of estrogenic activity of egonol gentiotrioside on HepG2 cells proliferation. This compound possessed significant activity on promoting estrogen response element(ERE)and cAMP response element(CRE)in HepG2 cells that was transfected with pERE-Luc and pCRE-Luc luciferase reporter gene.Modified HepG2 cells proliferation assay was used to evaluate the estrogenic activity of egonol gentiotrioside.The result showed that egonol gentiotrioside possessed similar pro-proliferation effect as 17β-estradiol.These evidences indicated the estrogenic activity of egonol gentiotrioside is involved in HepG2 cells proliferation.

egonol gentiotrioside;estrogenic activity;HepG2 cell;ERE(estrogen responsive element);CRE(cAMP response element)

R285.5;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0697-05

2009-05-20 接受日期:2009-06-09

＊通訊作者 Tel:86-28-85256758;E-mail:wangfei@cib.ac.cn