劉 潔 劉 盟 王 群湖南中醫(yī)藥大學第一中醫(yī)臨床學院（4008） 中南大學00屆外語畢業(yè)生（400）

兔不完全性截癱損傷脊髓血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化陽性表達的動態(tài)變化※

劉 潔1劉 盟2王 群1
1湖南中醫(yī)藥大學第一中醫(yī)臨床學院（410208） 2中南大學2010屆外語畢業(yè)生（410012）

目的 探討兔不完全性截癱后損傷脊髓血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）免疫組化陽性表達的動態(tài)變化，探討其在脊髓損傷過程中的作用。方法 采用壓迫法造成不完全截癱模型，傷后6h、7d、15d、取損傷脊髓組織3mm，用免疫組織化學S-P法染色，并用彩色圖象分析系統(tǒng)進行圖像分析。結果 脊髓損傷VEGF表達變化分為兩個階段：第一階段表達為最高峰值傷后6小時。第二階段表達峰值為傷后15d。結論 VEGF可為脊髓損傷的時間提供診斷依據(jù): 傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細胞浸潤，脊髓水腫時期，VEGF可為脊髓損傷提供治療依據(jù)：15d時，VEGF增加血管通透性，改善血液循環(huán)，增加生殖與遷移，主要是保護作用，促進脊髓損傷的愈合，加快修復部位主要是灰質部位. 治療上可大量使用活血化淤藥。

兔不完全截癱；VEGF陽性表達動態(tài)變化；脊髓神經(jīng)損傷時間的診斷治療依據(jù)

截癱，尤其是不完全性截癱，已成為臨床的常見病和疑難病。血管生長因子與神經(jīng)生長因子一樣，為神經(jīng)血管再生的重要物質。血管內皮生長因子的促血管新生、促神經(jīng)再生的作用，已開始運用于創(chuàng)傷愈合的領域中，在大腦彌漫性損傷中的表達已有資料報道①，在脊髓損傷中尚未見資料報道。我們對不完全性截癱兔的損傷脊髓部位的VEGF陽性表達作了動態(tài)觀察，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法：

1.1 材料 ①實驗動物與分組：由湖南中醫(yī)學院日本大耳白兔飼養(yǎng)中心提供健康雄性日本大耳白兔40只，體重2.0～2.5kg。隨機分為非脊髓損傷組。造模損傷6h組、7天組、15天組，每組10只。②兔不完全性截癱模型的制備采用壓迫法③造成不完全性脊髓損傷。對照組與模型組常規(guī)麻醉，顯露第七腰椎間孔切斷黃韌帶，插入麻醉導管膠囊，并用皮膚尾線固定，但不注入典必樂，不予壓迫。24h后拔掉導管。

在模型組形成6h、7d、15d時，空氣栓塞分批處死大耳白兔。電鏡液固定損傷脊髓部位，取3mm長，損傷脊髓用10%的中性福爾馬林固定液再固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.2 主要試劑 兔抗兔VEGF單克隆抗體、SP免疫組織化學試劑盒，DAB顯色劑，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 VEGF免疫組化染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；②10%過氧化氫37℃孵育10min，微波抗原修復；③羊血清孵育10min，滴加一抗4℃過夜；④滴加二抗37℃孵育30min；⑤滴加三抗37℃孵育30min；⑥DAB顯色蘇木素復染；⑦脫水透明封片。

1.3.2 圖象分析和統(tǒng)計處理 應用美國產(chǎn)Optimas 6.51彩色圖象分析系統(tǒng)（湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷研究所提供），40×10倍視野顯微鏡下對VEGF免疫組織化學染色陽性反應物進行定量檢測，分別測定損傷脊髓灰質（前、后角，灰質聯(lián)共5個視野）和白質（前后索側索共6個視野），灰、白質共11個視野陽性信號數(shù)（Var?of Cray）和灰度（Mean Gray）。

用SPSS.11.5統(tǒng)計軟件進行方差分析和q檢驗，P＜0.05視為兩組有顯著性差異。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色顯微鏡下結果 如圖片

2.2 免疫組化圖像分析陽性反應灰度與信號數(shù)變化 如表1。

表1 脊髓灰、白質不同階段的動態(tài)變化 n=照相張數(shù)

如表1所示，正常組VEGF陽性信號的灰度主要表達在脊髓白質（前后側索），陽性表達灰度明顯比灰質高，但顆粒含量差異不顯著。

模型組灰質部位（前角、后角）VEGF陽性信號灰度6h與（非脊髓損傷組）無顯著差異，但陽性信號數(shù)開始顯著升高，呈4個時相的最高峰。6h損傷脊髓灰質、白質的灰度與信號數(shù)比較顯著差異。白質部位灰度明顯呈下降趨勢，但與正常組無差異，信號數(shù)明顯升高呈4h相的最高值。

7d時灰質部位（前角、后角）陽性信號灰度較正常組，顯著升高，表現(xiàn)為四個時相的最高峰，但陽性信號數(shù)已開始下降，較6h出現(xiàn)顯著差異。仍明顯高于正常組。白質灰度亦明顯高于6h時，陽性信號數(shù)開始顯著下降，明顯低于6h時高于正常組。7d時灰白質、灰度與信號數(shù)比較均無顯著差異。

15d時灰質部位（前角、后角）陽性信號灰度，顯著低于7d時灰度，但仍明顯高于6h組和非脊髓損傷組，但信號數(shù)又呈升高相，出現(xiàn)四個時相的次高峰。白質部位陽性信號灰度呈下降趨勢明顯低于7d時，信號數(shù)又開始升高，出現(xiàn)四個時相的次高峰?；屹|與白質灰度比較呈現(xiàn)顯著差異。

3 討論

VEGF在脊髓損傷中的作用：目前，有關VEGF在脊髓損傷中的表達未見詳細資料報道，但在腦損傷修復和腦缺血中有大量資料報道。大鼠彌漫性腦損傷中，在傷后6h陽性信號數(shù)達峰值，主要部位在神經(jīng)元內[1]。與我們所測的資料相一致。本項觀察的第一個峰值也在6h，在灰質白質均有表達，均與非脊髓損傷組出現(xiàn)顯著差異。脊髓損傷7d時灰、白質灰度出現(xiàn)最高值，而顆粒數(shù)相對減少這與損傷組織的自然凋亡有關。至15d時顆粒含量出現(xiàn)次高峰，灰質灰度較7d時又開始下降，白質的灰度變化不明顯，從損傷以前15d來看，VEGF表達活躍主要反應在灰質部位。

關于VEGF的神經(jīng)保護方面的研究近幾年來發(fā)展迅速，VEGF是通過內皮細胞上的特異性受體發(fā)揮作用，Kilic等[2](2006)發(fā)現(xiàn)缺氧時VEGF主要通過其受體(特別是VEGF-2受體)激活P13K/Akt pathway起到保護神經(jīng)及增加血管通透性的作用。目前發(fā)現(xiàn)至少有3種受體與VEGF有關，包括KDR/FLK、FLT1、FLT4。VEGF通過受體結合，增加血管通透性和促進新生血管形成，傷后6h為脊髓損傷的最高峰期主要是脊髓出血，炎細胞浸潤，脊髓水腫時期。這個表現(xiàn)與損傷脊髓血管內皮細胞生長因子陽性信號數(shù)呈高峰狀態(tài)相一致，亦和光電鏡的表現(xiàn)相一致。一方面VEGF主要是增加血管通透性破壞血腦脊屏障，促進脊髓水腫加重脊髓損傷，另一方面增加脊髓血管通透性，是為促進新生血管形成，改善脊髓血液循環(huán)，促進脊髓再生做準備。VEGF第二個高峰是在損傷的15d，增加血管通透性，改善血液循環(huán)，增加生殖與遷移，主要是保護作用，促進脊髓損傷的愈合，加快修復部位主要是灰質部位。因為15d灰質部位的灰度又開始出現(xiàn)差異與非脊髓損傷組表現(xiàn)一致。VEGF促進血管生長，增加血氧供應，從而促進細胞存活；VEGF也可直接作用于神經(jīng)元，抗細胞凋亡、降低氧化應激、調節(jié)離子通道、抑制突觸傳遞和細胞興奮性，以及促進神經(jīng)元再生等。Krum和Khaibullina(2003)[4]發(fā)現(xiàn)VEGF是大腦修復中的中心環(huán)節(jié)，它是血管內皮存活和增生的關鍵。梅欣明等使用當歸注射液治療宮內缺氧大鼠,可上調大鼠大腦皮質VEGFmRNA的表達. 脊髓損傷15d時,治療上可大量使用活血化淤藥。

綜上所述，VEGF四個時相的表現(xiàn)是診斷脊髓損傷分析的高精確靈敏指標，可望為脊髓損傷形成不同階段動態(tài)變化時間和修復時間提供參考，并為臨床治療提供指導意義。

[1] 李梅,廖志鋼,王欣,等.大鼠彌漫性腦損傷中血管內皮生長因子表達變化的實驗研究[J].法律與醫(yī)學雜志.2002,9(2):96.

[2] 劉潔,胡湘明,劉光國,等,建立兔急性壓迫型不完全性截癱模型的實驗研究[J].湖南中醫(yī)學院學報2003,23(5):1.

[3] kilic E,KiLic U,Wang Y,et al. the phosphatidylinositiol-3 kinase/akt pathway mediates VEGF’s neuroprotective activity and induces blood brarrier permeability after focal cerebral ischemia[J],FASEBJ, 2006,20(8)1185-1187

[4] Krum JM,Khaibullina A. Inhibition of endogenbous VEGF impedes revasc ularization and astroglial prolifenration:roles for vegf in brain repair[J].Exp Neurol, 2003,181(2):241-257.

[5] 梅欣明,劉敦玉,趙峰等.當歸對宮內缺氧新生大鼠大腦皮質神經(jīng)元與VEGFmRNA表達的影響[J].四川動物,2010.vol29(1),2010.

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.18.177

1672-2779（2010）-18-242-03

國家自然科學基金資助項目[No：399709260]

2010-05-28）