孟 玲, 王 雷

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

H2O2/HAc協(xié)同降解制備水溶性殼聚糖及其抑菌性研究

孟 玲, 王 雷

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧沈陽 110142)

采用 H2O2/HAc協(xié)同降解法對殼聚糖進(jìn)行降解.通過正交實(shí)驗(yàn)獲得 16種水溶性殼聚糖片段,并對降解條件進(jìn)行研究.以水稻紋枯菌Rhizzctania solaui、小麥赤霉病Fusarium gram inearum以及小麥根瘤病Helm inthnsporium sativum3種植物常見病原菌作為實(shí)驗(yàn)菌種,利用含毒介質(zhì)法分別測定 16種水溶性殼聚糖對上述 3種病原菌的抑菌效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,降解后的片段較未降解前具有較好的抑菌作用;同一片段在高濃度時(shí)的抑菌效果高于低濃度;同一降解條件下獲得的水溶性殼聚糖片段對不同植物病菌的抑制作用效果不同.

H2O2/HAc; 水溶性殼聚糖; 降解; 抑菌作用

甲殼素 (chitin)是除植物纖維素外的第二大生物資源,殼聚糖 (Chitosan)是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物.殼聚糖具有良好的生物相容性,在農(nóng)業(yè)、食品、日用化學(xué)品等方面具有廣泛的應(yīng)用[1].研究表明,殼聚糖可作為植物生長調(diào)節(jié)劑,促進(jìn)農(nóng)作物產(chǎn)量提高,還可作為土壤改良劑及用于收獲后農(nóng)產(chǎn)品的保鮮等,尤其在抑制植物病害方面已逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)[2].如殼聚糖可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗性,增強(qiáng)植物的自身防衛(wèi)能力,抑制多種植物病原微生物的生長,而且對環(huán)境不會造成污染[3-6].由于殼聚糖 (Chitosan)相對分子質(zhì)量大,一般在數(shù)十萬甚至上百萬,因而水溶性差,使其在應(yīng)用方面受到了很大的限制.殼聚糖經(jīng)降解生成的低聚合度的殼聚糖片段具有較高的溶解度,易被吸收利用,更顯示其獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)[7].關(guān)于相對分子質(zhì)量對殼聚糖抑菌性能的影響已有不少研究,但是研究結(jié)果并不統(tǒng)一[8-9].本文通過不同條件下H2O2/HAc協(xié)同降解殼聚糖的研究,獲得一系列的水溶性殼聚糖片段,并將各種片段對水稻紋枯菌、小麥赤霉病和小麥根瘤病 3種植物病菌的抑制作用分別進(jìn)行了初步的研究.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

殼聚糖,金湖甲殼食品有限公司,脫乙酰度>90%,相對分子質(zhì)量 30萬,食品級;雙氧水、乙酸、乙醇、磷酸氫二鈉、硝酸鈣、蔗糖、蛋白胨和瓊脂均為分析純;供試病原菌:水稻紋枯菌(Rhizzctania solaui)、小麥赤霉病(Fusarium gram inearum)和小麥根瘤病(Helm inthnsporium sativum),由沈陽化工研究院農(nóng)藥生測中心提供.

LDZX-40B I立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器, LD4-2低速離心機(jī),JJ-1電動攪拌器,DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,LRH-280生化培養(yǎng)箱,HNP-水平流形超凈工作臺,FA1104電子天平.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性殼聚糖的制備

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表 (見表 1、表 2),將殼聚糖(CTS)溶解于稀乙酸(HAc)水溶液中,快速升溫到所需溫度,在攪拌條件下滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的 H2O2,反應(yīng)若干時(shí)間后,調(diào)節(jié) pH值為7.0～7.5,抽濾,濾液在室溫條件下醇沉,3 000 r/min離心 15 min,將固體于 60℃烘箱中干燥30 min后,得水溶性低聚殼聚糖.

表 1 H2O2/HAc降解殼聚糖因素水平表Table 1 The factor levels of degradation soluble chitosan through HAc/H2O2

表 2 5因素 4水平表Table 2 Designed normal test(5 factors and 4 leves)

1.2.2 水溶性殼聚糖產(chǎn)率的測定

根據(jù)產(chǎn)物 (水溶性殼聚糖)質(zhì)量與原料 (殼聚糖)質(zhì)量的比值計(jì)算水溶性殼聚糖的產(chǎn)率.

1.2.3 殼聚糖降解片段抑菌效果測定

采用含毒介質(zhì)法[10],供試藥劑為不同相對分子質(zhì)量的殼聚糖乙酸溶液,殼聚糖質(zhì)量濃度分別為 10 mg/L和 100 mg/L,各供試菌種均另設(shè)不加殼聚糖的乙酸溶液作為空白對照.每實(shí)驗(yàn)號設(shè) 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).

將 PDA培養(yǎng)基加入殼聚糖乙酸溶液充分混合,高壓蒸汽滅菌后,待其冷卻后接種直徑0.5 cm的病原菌菌片,放置培養(yǎng)箱中 25℃培養(yǎng)1～2 d后進(jìn)行調(diào)查,調(diào)查時(shí)分別測量每個(gè)處理的供試病原菌菌落生長直徑,并計(jì)算抑菌率.

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性殼聚糖產(chǎn)率的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用正交實(shí)驗(yàn),采用 H2O2/HAc降解殼聚糖,獲得不同的水溶性殼聚糖片段,其產(chǎn)率結(jié)果見表 3.

表 3 水溶性殼聚糖產(chǎn)率的測定結(jié)果Table 3 The result of productivity of soluble chitosan

由表 3可知,獲得最佳水溶性殼聚糖產(chǎn)率的降解條件是:殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%,乙酸體積分?jǐn)?shù)為 4%、雙氧水與殼聚糖摩爾比為 4、反應(yīng)溫度為 80℃、反應(yīng)時(shí)間為 4 h.根據(jù)極差大小可看出各因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度,5個(gè)因素的影響大小為:殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) >雙氧水與殼聚糖摩爾比 >反應(yīng)時(shí)間 >乙酸體積分?jǐn)?shù) >反應(yīng)溫度.

2.2 殼聚糖降解片段的抑菌作用結(jié)果

利用含毒介質(zhì)法,對正交實(shí)驗(yàn)獲得的 16種水溶性殼聚糖的抑菌效果進(jìn)行研究,其中零號為未降解處理的殼聚糖.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 4、圖 1～圖 3.

表 4 水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果Table 4 Inhibition effects of soluble chitosan products forRhizzctania solaui

圖 1 水溶性殼聚糖產(chǎn)物對水稻紋枯菌抑菌效果Fig.1 Inhibition effects of soluble chitosan products forRhizzctania solaui

由圖 1可以看出,未降解處理的非水溶性殼聚糖的抑菌活性較降解得到的水溶性的殼聚糖差,當(dāng)培養(yǎng)基中水溶性殼聚糖質(zhì)量濃度為 100 mg/L時(shí),對水稻紋枯病具有一定的抑菌效果.由表 4可知,根據(jù)降解得到的 16種水溶性殼聚糖抑菌率,對制備這 16種水溶性殼聚糖的降解條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析,可得出具有最佳抑菌作用的殼聚糖的降解條件為殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%,乙酸體積分?jǐn)?shù) 2%、雙氧水與殼聚糖摩爾比為 4、反應(yīng)溫度 80℃、反應(yīng)時(shí)間 2 h.當(dāng)質(zhì)量濃度降至10 mg/L時(shí),水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌率均在 30%以下.由圖 1可見,除少數(shù)情況外,同一片段的水溶性殼聚糖在高濃度時(shí)較低濃度的抑菌活性更高.

由圖 2可以看出,未降解處理的非水溶性殼聚糖的抑菌活性較降解得到的水溶性的殼聚糖差.根據(jù) 16種水溶性殼聚糖對小麥赤霉菌的抑菌率,對降解條件的正交實(shí)驗(yàn)分析得到具有最佳抑菌作用的殼聚糖的降解條件:殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%,乙酸體積分?jǐn)?shù) 4%、雙氧水與殼聚糖摩爾比為 4、反應(yīng)溫度 80℃、反應(yīng)時(shí)間為 4 h,對小麥赤霉病的抑菌效果最好.當(dāng)質(zhì)量濃度降至 10 mg/L時(shí),水溶性殼聚糖對小麥赤霉病的抑菌率均在 30%以下,除 2號、3號實(shí)驗(yàn)條件降解得到的產(chǎn)物外,其他條件下得到的同一片段的水溶性殼聚糖在高濃度時(shí)的抑菌活性明顯高于較低濃度時(shí)的抑菌活性.

圖 2 水溶性殼聚糖產(chǎn)物對小麥赤霉病抑菌效果Fig.2 Inhibition effects of soluble chitosan products forFusarium gram inearum

由圖 3可以看出,未降解處理的非水溶性殼聚糖的抑菌活性較降解得到的水溶性的殼聚糖差.根據(jù) 16種水溶性殼聚糖對小麥根瘤菌的抑菌率,對降解條件的正交實(shí)驗(yàn)分析得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%,乙酸體積分?jǐn)?shù) 3%、雙氧水與殼聚糖摩爾比為 2、反應(yīng)溫度 70℃、反應(yīng)時(shí)間為 2 h時(shí),降解制備的水溶性殼聚糖對小麥根瘤病的抑菌效果最好.當(dāng)質(zhì)量濃度降至 10 mg/L時(shí),水溶性殼聚糖對小麥根瘤病的抑菌率明顯降低.

圖 3 水溶性殼聚糖產(chǎn)物對小麥根瘤病抑菌效果Fig.3 Inhibition effects of soluble chitosan products forHelm inthnsporium sativum

2.3 各種因素對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響

2.3.1 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌率的影響

研究殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌率的影響實(shí)驗(yàn)中,殼聚糖的抑菌質(zhì)量濃度均為100 mg/L,結(jié)果如圖 4所示.由圖 4可以看出,當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 3%時(shí),提取的水溶性殼聚糖產(chǎn)物對水稻紋枯菌和小麥赤霉病的抑菌效果均達(dá)到較大值,抑菌率為 27.727%.而當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%時(shí),獲得的水溶性殼聚糖對小麥根瘤病的抑菌率達(dá)到最大值,為23.134%.因此選擇殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 2%～3%進(jìn)行降解可以得到較好抑菌效果的水溶性殼聚糖.

圖 4 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌率的影響Fig.4 The effect ofmass concentration of CTS for inhabition rate of soluble chitosan

2.3.2 乙酸體積分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌率的影響

研究乙酸體積分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌率的影響,所有實(shí)驗(yàn)中殼聚糖的抑菌質(zhì)量濃度均為100 mg/L,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 5所示.從圖 5可以看出,水溶性殼聚糖對水稻紋枯病和小麥赤霉病的抑菌效果受乙酸含量的影響較大,當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí),水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果最好,抑菌率為 32.954%.當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí),水溶性殼聚糖對小麥根瘤病的抑菌效果最好,抑菌率為 20.612%.當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 4%時(shí),水溶性殼聚糖對小麥赤霉病的抑菌效果最好抑菌率為 32.325%.

圖 5 乙酸體積分?jǐn)?shù)對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響Fig.5 The effect ofvolume concentration of HAc for inhabition rate of soluble chitosan

2.3.3 溫度對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響

反應(yīng)溫度對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響如圖 6所示.

圖 6 反應(yīng)溫度對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響Fig.6 The effect ofmol ratio ofreaction temperature for inhabition rate of soluble chitosan

所有溶液中殼聚糖的抑菌質(zhì)量濃度均為100 mg/L,在 50～80℃之間隨溫度的升高,獲得的水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果逐漸增加,80℃時(shí)的抑菌率為 34.545%.而對于小麥根瘤病和小麥赤霉病的抑菌效果并無規(guī)律可循,如果要獲得外觀顏色淺的片段且具有較好的抑菌效果,可采用 50℃降解條件獲得的水溶性殼聚糖產(chǎn)物.

2.3.4 雙氧水與殼聚糖摩爾比對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響

殼聚糖抑菌質(zhì)量濃度仍是 100 mg/L,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 7所示.由圖 7可以看出,當(dāng)雙氧水與殼聚糖的摩爾比在 0.5～1之間時(shí),水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果逐漸下降,雙氧水與殼聚糖的摩爾比在 1～2之間時(shí),水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果表現(xiàn)平穩(wěn),當(dāng)雙氧水與殼聚糖的摩爾比達(dá)到 2～4之間時(shí),水溶性殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果逐漸增大,當(dāng)摩爾比為 4時(shí),殼聚糖對水稻紋枯菌的抑菌效果達(dá)到最大值,抑菌率為 34.772%.當(dāng)雙氧水與殼聚糖的摩爾比為 4時(shí),提取的水溶性殼聚糖對小麥赤霉病的抑菌效果最好,抑菌率為 25.159%.當(dāng)雙氧水與殼聚糖的摩爾比為 2時(shí),提取的水溶性殼聚糖對小麥根瘤病的抑菌效果最好,抑菌率為25.128%.

圖 7 雙氧水與殼聚糖摩爾比對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響Fig.7 The effect ofmol ratio between H2O2and CTS for inhabition rate of soluble chitosan

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響

在抑菌效果方面,殼聚糖的抑菌質(zhì)量濃度為100 mg/L.反應(yīng)時(shí)間對水稻紋枯病的抑菌效果影響較大,結(jié)果見圖 8.從圖 8可以看出,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 2 h時(shí),提取的水溶性殼聚糖對水稻紋枯病和小麥根瘤病的抑菌效果最好,抑菌率分別為38.182%和 25.319%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)增加到 4 h時(shí),提取的水溶性殼聚糖對小麥赤霉病的抑菌效果最好,抑菌率為 23.911%.

圖 8 反應(yīng)時(shí)間對水溶性殼聚糖抑菌效果的影響Fig.8 The effect of reaction time for inhabition rate of soluble chitosan

3 結(jié) 論

(1)采用 H2O2/HAc協(xié)同降解殼聚糖,可獲得一系列的水溶性殼聚糖片段.獲得最佳水溶性殼聚糖產(chǎn)率的降解條件是:殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,乙酸體積分?jǐn)?shù)為 4%、雙氧水與殼聚糖摩爾比為 4、反應(yīng)溫度為 80℃、反應(yīng)時(shí)間為 4 h.5個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度大小為:殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) >雙氧水與殼聚糖摩爾比 >反應(yīng)時(shí)間 >乙酸體積分?jǐn)?shù) >反應(yīng)溫度.

(2)各種水溶性殼聚糖片段分別對水稻紋枯菌、小麥赤霉病和小麥根瘤病 3種植物病菌的抑制作用研究表明,降解后的片段較未降解前具有較好的抑菌作用;大部分情況下同一片段在高濃度的抑菌效果高于低濃度;同一降解條件下獲得的水溶性殼聚糖片段對不同的植物病菌的抑制作用效果不同.

[1] Cheng M ingyu,Deng Jinguang,Yang Fei,et al.Study on Physical Properties and Nerve Cell Affinity of Composite Films from Chitosan and Gelatin Solutions [J].B iom aterials,2003,24(17):2871-2880.

[2] 郎剛?cè)A,陳西廣,劉成圣,等.殼聚糖及其衍生物在生物工程領(lǐng)域中的應(yīng)用研究[J].海洋科學(xué),2001, 25(7):25-28.

[3] 馬鵬鵬.甲殼素及其衍生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)通訊,2001,37(5):475-478.

[4] 賴凡,雷朝亮,鐘昌珍.蠅蛆幾丁糖對幾種植物病原真菌的抑制作用[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998, 17(2):122– 125.

[5] 水茂興,馬國瑞,陳美慈,等.殼聚糖添加助劑保鮮草莓的效應(yīng)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào) (農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2001,27(3):343-344.

[6] Struszczyk Henryk,Pospieszny Hehryk.N ew Applications of Chitin and Itsderivatives in Plant Protection[M]//Goosen M attheus F A.Application of Chitin and Chitosan.Lancaster:Technom ic Publishing Company,1997:129-139.

[7] Chiang M T,Yao H T,Chen H C.Effect of D ietary Chitosans with D ifferent V iscosity on Plasm a L ipids and L ipid Peroxidation in Rats Fed on a D iet Enriched with Cholesterol[J].B iosci B iotechnol B iochem,2000,64(5):965.

[8] 宗獻(xiàn)周,沈月新.不同平均分子量的α-殼聚糖的抑菌作用[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,9(2):138-141.

[9] Jeon Y J,Park P J,Kim S K.A ntim icrobial Effect of Chitooligosaccharides Produced by B ioreactor[J]. Carbohydrate Polym er,2001,44(1):71-76.

[10]L in W L,Hu X Y,ZhangW Q,et al.Hydrogen Peroxide M ediates Defence Responses Induced by Chitosans of D ifferentM olecularW eights in Rice[J]. Journal of Plant Physiology,2005,162(8):937-944.

Preparation of Soluble Chitosan Through HAc/H2O2Coordinated Reaction and Inhibition on Phytopathogenic Fungi

M ENG L ing, WANG Lei
(Shenyang U niversity of Chem ical Technology,Shenyang110142,China)

Chitosan was degradate through H2O2/HA c coordinated reaction,and16kinds of soluble chitosan fragm ents w ere obtained by orthogonal experim ents and degradation conditions w ere studied.Three comm on phytopathogenic fungi:Rhizzctania solaui,Fusarium gram inearum and Helm inthnsporium sativum as experim ental objects.By using toxic m edium m ethod,16kinds of soluble chitosan fragm ents act on the three phytopathogenic fungi,respectively.The experim ental results show ed that the fragm ents after degradation had better effects than not degradation;the inhibition rates of sam e fragm ent at high concentrations w ere better than those at low concentrations;for different phytopathogenic fungi,there w ere different effects of soluble chitosan fragm ents w hich w ere obtained with sam e degradation conditions.

H2O2/HA c; soluble chitosan; degradation; inhibition

S482.2

A

1004-4639(2010)03-0209-06

2009-09-16

孟玲(1969-),女,吉林吉林人,副教授,博士,主要從事生物農(nóng)藥方面的研究.