陳默然，張 巍，沈 楠，趙行宇

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 科研處， 吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林醫(yī)藥學(xué)院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

雌激素與山核桃油干預(yù)對(duì)去卵巢大鼠海馬早老基因-1與載脂蛋白E基因表達(dá)的影響

陳默然1，張 巍2，沈 楠3，趙行宇4,*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 科研處， 吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林醫(yī)藥學(xué)院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

目的：觀察雌激素干預(yù)后，核桃油對(duì)去卵巢大鼠海馬組織早老基因-1(PS-1)與載脂蛋白E(aproE)基因表達(dá)及勻漿液中β淀粉樣肽(Aβ)含量的變化。探討核桃油對(duì)PS-1、aproE表達(dá)的調(diào)節(jié)與雌激素(E2)間的關(guān)系。方法：以去卵巢雌性大鼠為動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予核桃油100mg/(kg bw·d)(低劑量組)、200mg/(kg bw·d)(中劑量組)、400mg/(kg bw·d) (高劑量組) (n=16)。空白組給予相同劑量的生理鹽水。各組一半的大鼠隨機(jī)接受E2處理，采用RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬PS-1與aproE基因表達(dá)，RIA檢測(cè)海馬Aβ的含量的變化，放免法測(cè)血清E2水平。結(jié)果：雌激素干預(yù)的模型鼠血清E2水平顯著高予未干預(yù)組(P＜0.01)；海馬Aβ含量空白組最高，隨核桃油劑量增加Aβ含量逐漸下降，中、高劑量組更顯著(P＜0.05)，E2干預(yù)后Aβ含量下降更明顯；空白組PS-1的表達(dá)最高而apoE的表達(dá)最低，隨核桃油劑量增加各劑量組PS-1的表達(dá)僅輕度下降，apoE-mRNA表達(dá)明顯增加；雌激素干預(yù)后PS-1的表達(dá)有所下降，apoE基因各組間表達(dá)差異消失。結(jié)論：E2和核桃油都可以通過(guò)降低去卵巢大鼠海馬的PS-1基因及增加aproE基因的表達(dá)來(lái)降低Aβ的水平；但二者對(duì)PS-1基因調(diào)節(jié)可能通過(guò)不同的途徑實(shí)現(xiàn)，而對(duì)apoE基因可能通過(guò)相同的途徑來(lái)調(diào)節(jié)。

RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ；去卵巢大鼠

Abstract：Objective: To study the effect of pecan oil on the serum estrogen (E2) level and gene expressions of Alzheimer gene -1 (PS-1) and apolipoprotein E (aproE) gene and Aβ content in the hippocampus of ovariectomized rats subjected to E2 intervention.Methods: Ovariectomized female rats were used as animal model and divided into 8 groups for 8 rats in each group: groups given low dose (100 mg/kg) pecan oil alone or plus E2, separately named low-dose pecan oil group and low-dose pecan oil plus E2 group,middle-dose pecan oil group and middle-dose pecan oil plus E2 group and high-dose pecan oil group and high-dose pecan oil plus E2group obtained similarly, control group (given only saline) and E2 group (given only E2). RT-PCR was used to detect the gene expressions of PS-1 and aproE in rat hippocampus, and radioimmunoassay to detect the level of Aβ in rat hippocampal and serum E2 level. Results: E2 intervention resulted in a significant (P＜0.01) increase in serum E2 level in ovariectomized rats. The highest Aβ level was observed in the control group. Regardless of whether or not E2 intervention was adopted, Aβ level gradually decreased with increasing pecan oil dosage and a significant difference (P＜0.05) was observed within both middle and high dose groups. The presence of E2 resulted in a large decrease in Aβ level in comparison with the control group, which exhibited the highest PS-1 gene expression but the lowest aproE gene expression. For rats both with and without E2 intervention, PS-1 geneexpression showed only a slight decrease with increasing pecan oil dosage, while aproE gene expression markedly increased.However, at the same pecan oil dosages, E2 intervention resulted in a slight decrease in PS-1 gene expression but did not affect.The differences in aproE gene expression among these three pecan oil dosage groups disappeared. Conclusion: Both E2 and pecan oil PS-1 can attenuate PS-1 gene expression and elevate aproE gene expression so as to reduce Aβ level. Their regulatory effects on PS-1 gene might be achieved by different pathways; however, the same pathway seem to be used by them to regulate aproE gene.

Key words：RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ ；ovariectomized rats

早老性癡呆(AD)的發(fā)生最終都可歸結(jié)于淀粉樣蛋白前體(APP)加工方式改變，從而導(dǎo)致β淀粉樣肽(Aβ)產(chǎn)生增加、沉積[1]，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，這一過(guò)程的影響因素包括遺傳學(xué)改變、細(xì)胞老化、炎性反應(yīng)、中毒反應(yīng)及內(nèi)分泌失調(diào)等。有多個(gè)遺傳基因參與這一過(guò)程的調(diào)節(jié)，Maheswaran等[2]的研究發(fā)現(xiàn)野生型早老基因-1(PS-1)轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)腦量減少，而PS-1可通過(guò)γ分泌酶活性調(diào)節(jié)Aβ的產(chǎn)生，說(shuō)明PS-1與AD的關(guān)系密切。其他的研究則揭示載脂蛋白E(apoE)可與脂蛋白受體相互作用，具有輸送和調(diào)節(jié)脂類代謝的作用[3]，神經(jīng)細(xì)胞apoE可與Aβ結(jié)合，形成apoE-Aβ復(fù)合物由中性粒細(xì)胞通過(guò)LRP介導(dǎo)清除[4]。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為山核桃具有健腦、抗衰老作用，可延緩AD的發(fā)生，然而這一作用的基因途徑并不清楚。近來(lái)的研究也表明，核桃油具有抗氧化[5-6]、降低膽固醇[7]，提高大鼠學(xué)習(xí)能力[8]的作用，這都為核桃油的抗衰老作用提供了證據(jù)。在AD病例中，女性是男性的2倍以上[9]，且在絕經(jīng)后發(fā)病增加[10]，另外的研究也表明雌激素可減少Aβ水平[11-12]。說(shuō)明AD的發(fā)生與雌激素的關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)雌激素不僅可使成年AKR 鼠腦皮質(zhì)PS-1基因表達(dá)與蛋白表達(dá)下調(diào)[13]，減少Aβ的沉積，還可通過(guò)刺激α分泌酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)APP代謝，減少Aβ的聚集[11]。山核桃的作用是否通過(guò)對(duì)PS-1、apoE的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)，以及其作用是否會(huì)受到體內(nèi)雌激素水平的調(diào)節(jié)，目前并沒(méi)有明確的報(bào)道。本研究旨在觀察雌激素與野生山核桃油共同作用時(shí)對(duì)去卵巢大鼠海馬PS-1和apoE表達(dá)及內(nèi)Aβ水平的影響，以探討其抗衰老作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

吉林野生核桃取其仁，烘干粉碎后，用石油醚在55℃水浴索氏提取6h，提取率為64.97%，油色淡黃，有香味；主要含有亞油酸63%、油酸18%、硬脂酸2%、棕櫚酸3.9%等脂肪酸及微量的VE。

血清雌二醇(E2)放射免疫分析藥盒 北京市福瑞生物工程公司；苯甲酸雌二醇 天津金耀氨基酸有限公司；Aβ放射性免疫試劑盒 天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；Trizol RNA分離試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Invitrogen公司。

γ放射免疫計(jì)數(shù)儀 安徽合肥科大創(chuàng)新有限股份公司；TC-512型PCR儀 英國(guó)Techne公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作與分組

去卵巢大鼠模型制作：Wistar成年雌性大鼠64只，10月齡，體質(zhì)量(230±20)g，購(gòu)于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性1周后，腹腔注射1g/100mL戊巴比妥鈉(30mg/(kg bw·d))麻醉、固定，背部切口去雙側(cè)卵巢，分層縫合。去卵巢1周后，陰道涂片，已無(wú)性周期變化。

實(shí)驗(yàn)分組：模型大鼠隨機(jī)分成8組(n=8)，對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、E2組、低劑量+E2組、中劑量+E2組、高劑量+E2組，前4組大鼠灌胃給與不同劑量核桃油：100mg/(kg bw·d)(低劑量組)、200mg/(kg bw·d)(中劑量組)、400mg/(kg bw·d)(高劑量組)，對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，持續(xù)9周；后4組大鼠除接受與前4組對(duì)應(yīng)的相同處理外，還接受雌激素處理，每只每3d腹腔注射苯甲酸雌二醇10μg；前4組與之對(duì)應(yīng)，腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 E2與Aβ含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠摘眼球取血，4℃冰箱靜置過(guò)夜，低速臺(tái)式離心機(jī)3000r/min離心10min，小心吸取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)E2的質(zhì)量濃度，單位用pg/mL表示。大鼠斷頭取腦在冰臺(tái)上迅速剝離出海馬組織，分為兩份，一份稱質(zhì)量、剪碎，加入10倍體積的冷生理鹽水，超聲勻漿， 4℃、3500r/min離心10min，取上清，按說(shuō)明書(shū)測(cè)Aβ含量，用每mg勻漿蛋白中含pg表示(pg/mg pro)。另一份檢測(cè)PS-1、aproE表達(dá)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)PS-1、aproE表達(dá)

取海馬組織各0.2g (每鼠取0.025g) 置5mL離心管中，加預(yù)冷的異硫氰酸胍變性溶液2mL，超聲勻漿。勻漿液采用Trizol RNA分離試劑提取RNA。取5μg總RNA，加入1μg的oligo(dT)l2-l8(0.5μg/μL)，按照Super-ScriptⅡ RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，合成cDNA第1鏈。PCR引物由primer5.0軟件設(shè)計(jì)， PS-1基因序列中1501～1701，片段長(zhǎng)201bp，上游引物：5＇-ctcgccattttcaagaa agc-3＇，下游引物：3＇-gggcttgctctctgtttttg-5＇；apoE基因 856～1064，序列長(zhǎng)209bp，上游引物：5＇-ggttcgagccaatagtggaa-3＇，下游引物：3＇-tattaagcaagggccaccag-5＇。各取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸7min。并以β-actin為內(nèi)參照，各取10μL反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清E2含量測(cè)定結(jié)果

各組血清E2水平見(jiàn)表1，雌激素處理前后的血清E2水平則差異顯著(P＜0.01)，雌激素處理組的E2水平明顯高于未處理組。

2.2 海馬勻漿液Aβ含量測(cè)定結(jié)果

海馬勻漿液Aβ含量見(jiàn)表2，對(duì)照組Aβ含量最高，E2干預(yù)后的含量明顯下降(P＜0.01)，隨著核桃油劑量的增加，海馬勻漿液Aβ含量不論是否經(jīng)過(guò)E2處理均為下降趨勢(shì)，但E2處理后的Aβ含量各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未經(jīng)過(guò)E2處理的劑量下降更明顯，與對(duì)照組比較中劑量組P＜0.05、高劑量組P＜0.01，表現(xiàn)為明顯的劑量負(fù)相關(guān)。

2.3 PS-1與apoE的mRNA表達(dá)

在實(shí)驗(yàn)條件下，PS-1與apoE的mRNA表達(dá)水平見(jiàn)圖1、3，對(duì)電泳圖的表達(dá)條帶進(jìn)行分析，計(jì)算基因與β-actin吸收峰面積的比值，見(jiàn)圖2、4。每組2只樣本，重復(fù)4次?？梢钥闯?，未接受雌激素處理的大鼠PS-1的表達(dá)最多，apoE的表達(dá)最少，隨核桃油劑量的增加，PS-1的表達(dá)減少，apoE的表達(dá)增加，與對(duì)照組比較，中、高劑量組差異顯著(P＜0.01)；在經(jīng)過(guò)雌激素處理后，較未處理的模型鼠PS-1的表達(dá)量雖有所下降，但趨勢(shì)與未經(jīng)過(guò)雌激素處理組相似；aproE的表達(dá)上升，但組間差異減少。

圖1 RT-PCR檢測(cè)不同劑量組PS-1基因表達(dá)Fig.1 RT-PCR analysis of PS-1 gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

圖2 不同劑量組海馬PS-1的表達(dá)水平比較(n=4)Fig.2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of PS-1 gene

圖3 RT-PCR檢測(cè)不同劑量組aproE基因表達(dá)Fig.3 RT-PCR analysis of aproE gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

表1 各組大鼠血清E2水平(n=8)Table 1 Effect of pecan oil alone or combined with E2on E2levels in ovariectomized rats (n=8)

表2 各組大鼠海馬勻漿液Aβ含量(n=8)Table 2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on Aβ levels in ovariectomized rats

圖4 不同劑量組組海馬aproE的表達(dá)水平比較(n=4)Fig.4 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of aproE gene

3 討 論

Aβ與AD發(fā)生的關(guān)系密切，而 PS-1是γ分泌酶的激動(dòng)劑，與β-分泌酶協(xié)同，剪切APP產(chǎn)生Aβ[14]，aproE則可以結(jié)合可溶性APP[15]，發(fā)揮清除Aβ的作用。目前大量的研究從Aβ產(chǎn)生與清除的角度來(lái)探索AD產(chǎn)生的機(jī)制。許多藥物都以自己的方式作用于這兩個(gè)環(huán)節(jié)，通過(guò)對(duì)Aβ產(chǎn)生及清除的干預(yù)來(lái)影響AD的產(chǎn)生和發(fā)展。

在本實(shí)驗(yàn)中觀察到E2可明顯的降低海馬組織中Aβ的含量，這與以前的研究[4]一致。在低E2水平，核桃油具有明顯的降低去卵巢大鼠海馬組織中Aβ含量的作用，量效關(guān)系明顯；而在高E2水平，作用進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明E2與山核桃之間有協(xié)同作用。這提示核桃油的攝入可以明顯降低Aβ水平，起到抗衰老的作用；婦女在更年期后體內(nèi)雌激素水平明顯下降，如果攝入適量的核桃油可降低腦內(nèi)Aβ含量，具有預(yù)防AD的作用。

實(shí)驗(yàn)還顯示，山核桃油具有減少PS-1表達(dá)、增加apoE表達(dá)的作用。E2干預(yù)使PS-1表達(dá)進(jìn)一步減少，作用相加，可以減少Aβ的生成。apoE的表達(dá)在E2干預(yù)后增加，而組間差異不明顯的結(jié)果表明，E2的存在可掩蓋山核桃油的作用，而apoE的表達(dá)總量不發(fā)生改變，二者具有明顯的交互作用?？梢酝茰y(cè)，山核桃油與E2在對(duì)PS-1的調(diào)節(jié)上，具有相對(duì)獨(dú)立性的途徑，而對(duì)apoE的調(diào)節(jié)可能通過(guò)相同的環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

以前的研究[16-17]中發(fā)現(xiàn)，E2的降A(chǔ)β的作用可以通過(guò)增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，激活α分泌酶的活性，使可溶性APP剪切產(chǎn)物增加，以及增加apoE的表達(dá)及調(diào)節(jié)膽堿合成等途徑實(shí)現(xiàn)。而山核桃油以何種形式進(jìn)行調(diào)節(jié)，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。總之山核桃油可通過(guò)下調(diào)PS-1、上調(diào)apoE表達(dá)來(lái)減少Aβ生成與提高Aβ的清除，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。特別是對(duì)絕經(jīng)期婦女預(yù)防早老癡呆的發(fā)生具有積極意義。

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Intervention Effect of Estrogen Combined with Pecan Oil on the Gene Expressions of Alzheimer gene -1 and Apolipoprotein E Gene in Ovariectomized Rat Hippocampus

CHEN Mo-ran1，ZHANG Wei2，SHEN Nan3，ZHAO Xing-yu4,*
(1. Research Division, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；2. Department of Biochemistry, Jilin Medical College,Jilin 132013, China；3. Center of Experiment, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；4. Department of Psychology,Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)15-0264-04

2009-12-02

陳默然(1977—)，男，講師，碩士， 研究方向?yàn)樯韺W(xué)。E-mail：jlmmczxy@163.com

*通信作者：趙行宇(1970—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樾睦韺W(xué)。E-mail：jlmpcxlx@163.com