呂鳳霞，姚正穎，別小妹，趙海珍，王 煜，郭 瑤，陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

內(nèi)生多黏類芽孢桿菌纖溶酶的純化及其體外溶栓作用

呂鳳霞，姚正穎，別小妹，趙海珍，王 煜，郭 瑤，陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

植物內(nèi)生菌株 EJS-3發(fā)酵液經(jīng)離心除菌，硫酸銨分級(jí)沉淀，Hiprep phenyl FF疏水層析，RESOURCEM Q離子交換層析和Sephacryl S-300HR凝膠過(guò)濾，獲得電泳純的多黏芽孢桿菌纖溶酶(PPFE-I)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定其分子質(zhì)量為63kD，高效液相色譜法(HPLC)鑒定其純度為94.1%。每升發(fā)酵液中可獲得1.6mg活性蛋白，每毫克蛋白活力達(dá)2096IU，純度提高了14.5倍，回收率為3.3%。純化后的纖溶酶PPFE-I具有明顯的體外溶栓作用。

植物內(nèi)生菌；多黏類芽孢桿菌；纖溶酶；純化；溶栓作用

Abstract ：Endophytes are a very important resource of microorganisms with potential application values. A novel fibrinolytic enzyme (PPFE-I) was purified from the fermentation supernatant of endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3 by the following procedure including ammonium sulfate precipitation, Hiprep phenyl FF hydrophobic chromatography, RESOURCEM Q ion exchange chromatography and Sephacryl S-300HR gel filtration. The apparent molecular mass of PPFE-I was estimated to be 63 kDa by SDS-PAGE analysis. The purity of PPFE-I was 94.1% determined by HPLC. Using the above procedure, 16 mg of active proteins were obtained from 1 L of the fermentation supernatant of Paenibacillus polymyxa EJS-3 and a 14.5-fold increase in the specific activity of PPFE-I was achieved and the activity recovery was 3.3%. Meanwhile, the final purified product had good thrombolytic activity in vitro.

Key words：endophytes；Paenibacillus polymyxa；fibrinolytic enzyme；purification；thrombolytic effect

溶栓療法是血栓性疾病安全有效的治療手段。現(xiàn)有的溶栓藥物療效顯著，但還存在特異性不高、半衰期短、易出血、再栓塞及價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)發(fā)新型溶栓藥物顯得十分迫切。微生物是溶栓藥物的重要來(lái)源。目前，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多微生物能夠產(chǎn)生纖溶酶或纖溶酶原激活劑，既有細(xì)菌[1-9]、放線菌[10-12]，又有真菌[13-17]和藻類[18-20]。纖溶酶的產(chǎn)生菌大都是從土壤微生物或東方傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選，但有關(guān)內(nèi)生菌來(lái)源纖溶酶的研究報(bào)道，尚不多見(jiàn)。

植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源已引起了廣泛的關(guān)注。已有研究表明，許多中藥具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，包括生物堿類、黃酮類以及皂甙等化合物[21]。生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌，由于其與宿主植物在長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過(guò)程中建立起互惠共存、相互制約的和諧聯(lián)合關(guān)系，使內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[22]。因此，從中藥植物內(nèi)生菌資源中可尋找和發(fā)現(xiàn)一些新型的溶栓藥物。

本研究室在中藥百部組織中分離篩選到一株具有纖溶活性較高和良好體外溶栓效果的多黏類芽孢桿菌EJS-3[23]，對(duì)其產(chǎn)生纖溶酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)該酶的體外溶栓作用作初探，為研制和開(kāi)發(fā)新型的溶栓劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Paenibacillus polymyxa EJS-3為本實(shí)驗(yàn)室篩選、保藏。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂20，pH7.2； 種子培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、蛋白胨10、牛肉浸膏5、NaCl 5，pH7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯100、胰蛋白胨5、酵母膏5、CaCl20.2、MgSO40.2、K2HPO42.5、KH2PO41，pH7.2。

牛血清白蛋白、纖維蛋白原 Sigma公司；凝血酶、尿激酶均為標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；瓊脂糖(電泳級(jí)) 中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；分子質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Biouniquer Technology有限責(zé)任公司 ；Hiprep phenyl FF、RESOURCEM Q、Sephacryl S-300HR GE Healthcare公司；其他試劑均為市售分析純。

pH計(jì) 美國(guó)Orion公司；高壓蒸氣滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；HYG-A全溫?fù)u瓶柜 江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；5804R冷凍離心機(jī) Eppendorf公司；UV-2450分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；冷凍干燥機(jī) 英國(guó)Labconco公司； PAC1000微型電泳儀 生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；1100series高效液相色譜(配有VWD檢測(cè)器) Agilent公司；KTA Prime 液相層析系統(tǒng) 英國(guó)GE Healthcare 公司；ULT RAFLEX Ⅱ MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 纖溶酶粗酶液的制備

將保存的Paenibacillus polymyxa EJS-3轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h。從新鮮的斜面培養(yǎng)物中，挑取2環(huán)接種于100mL種子培養(yǎng)基中，33℃、150r/min培養(yǎng)22h，獲得種子液。按體積分?jǐn)?shù)4%的接種量接入裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中，33℃、150r/min培養(yǎng)72h后，將發(fā)酵液5000×g離心20min收集上清液。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Bradford法[24]，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.3 纖溶活性的測(cè)定

纖溶酶的纖溶活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[25]。

1.2.4 纖溶酶的分離純化

1.2.4.1 硫酸銨分段鹽析

取100mL發(fā)酵液中分別加入不同量的固體硫酸銨至0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%飽和度，4℃靜置過(guò)夜，10000×g離心20min后測(cè)定上清液的纖溶活性，繪制硫酸銨鹽析曲線。根據(jù)硫酸銨分段鹽析制備粗酶液。

1.2.4.2 Hiprep phenyl FF疏水層析

先用含1mol/L NH4SO4的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)平衡預(yù)裝柱(1.6cm×10cm)。將纖溶酶粗酶液加入NH4SO4至其終濃度為1mol/L，上柱，按含1.0、0.9、0.8、0.5、0.2、0.05、0mol/L NH4SO4的 20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)階段梯度洗脫，流速為3mL/min，分部收集，280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，測(cè)定纖溶酶活力，收集活性峰，透析脫鹽或用Sephadex G-25凝膠過(guò)濾脫鹽，凍干備用。

1.2.4.3 RESOURCEM Q離子交換層析

用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)平衡RESOURCEM Q柱，將疏水層析得到的活性成分用同樣的緩沖液溶解后上樣，用含0～1.5mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl(pH8.5)線性梯度洗脫，流速為2mL/min，分部收集，280nm波長(zhǎng)處，測(cè)定纖溶酶活力，收集活性峰，凍干備用。

1.2.4.4 Sephacryl S-300HR凝膠過(guò)濾

用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)平衡Sephacryl S-300HR柱(1.6cm×10cm)，將陰離子交換層析得到的活性組分用同樣的緩沖液溶解后上樣。上樣后用同樣的緩沖液以0.5mL/min的流速洗脫，280nm波長(zhǎng)處，測(cè)定纖溶酶活力，收集活性峰，冷凍干燥。

1.2.4.5 SDS-PAGE分子質(zhì)量檢測(cè)

參照Laemmli[26]報(bào)道的方法進(jìn)行，10%分離膠，5%濃縮膠。電泳完畢后，取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。

1.2.4.6 HPLC純度鑒定

采用ODS C18(4.6mm×150mm)色譜柱，將純化的0.4mg/mL樣品上樣20μL，流動(dòng)相A為0.1%TFA-水，流動(dòng)相B為0.1%TFA-乙腈，用B液從零洗脫到100%，洗脫30min，線性梯度，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。

1.2.5 纖溶酶酶液體外血凝塊的溶解作用

取健康人全血6mL，置試管中自然凝固4～5h，將血凝塊切成小塊，用濾紙將其吸干，稱質(zhì)量，分別放入12支滅菌小試管中，編號(hào)，在1～6號(hào)試管中加入1mL生理鹽水，6～12號(hào)試管中加入1mL，150IU/mL纖溶酶酶溶液，將12支試管同時(shí)置于37℃水浴 90r/min搖床，分別于12、24h后將血塊取出吸干，稱量剩余血塊質(zhì)量，計(jì)算血凝塊溶解率。

式中：m為實(shí)驗(yàn)前血栓質(zhì)量；m1為實(shí)驗(yàn)后血栓質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖溶酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨分段鹽析

纖溶酶發(fā)酵液的硫酸銨鹽析曲線如圖1所示。隨著硫酸銨飽和度的增加，上清液中纖溶酶活性逐漸減少，沉淀中纖溶酶活性逐漸增加。當(dāng)硫酸銨小于30%飽和度時(shí)，上清液幾乎沒(méi)有沉淀，而在70%飽和度時(shí)完全沉淀，故在分離純化過(guò)程中首先采用30%飽和度硫酸銨沉淀去除雜蛋白，再用70%飽和度硫酸銨沉淀纖溶酶，并將沉淀溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4緩沖液中。

圖1 硫酸銨鹽析曲線Fig.1 Salting-out curve of protein using ammonium sulfate

2.1.2 Hiprep phenyl FF疏水層析

經(jīng)分段鹽析粗提純得到的粗酶液進(jìn)行疏水相互作用層析。疏水層析洗脫曲線如圖2所示。酶比活力測(cè)定結(jié)果表明，內(nèi)生菌多黏芽孢桿菌EJS-3發(fā)酵產(chǎn)生3個(gè)纖溶活性組分，洗脫峰III、Ⅳ、Ⅴ的酶比活力分別為116.3、524.1、77.0 IU/mL，其中在0.2mol/L硫酸銨梯度時(shí)洗脫峰Ⅳ具有最高活性。選擇此活性組分作進(jìn)一步分離純化。經(jīng)過(guò)Hiprep phenyl FF疏水層析可去除大量雜蛋白，達(dá)到進(jìn)一步純化目的。

圖2 Hiprep phenyl FF疏水層析圖譜Fig.2 Hiprep phenyl FF chromatographic fractionization of the fibrinolytic enzyme extract on Hiprep phenyl FF chromatography

2.1.3 RESOURCEM Q離子交換層析

對(duì)疏水作用層析后的洗脫峰Ⅳ樣品進(jìn)行RESOURCEM Q離子交換層析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 RESOURCEM Q離子交換層析圖譜Fig. 3 RESOURCEM Q chromatographic fractionization of the active fraction of (the fourth peak, see Fig.2) the fibrinolytic enzyme extract

從圖3看出，穿透峰較低，說(shuō)明選用的柱材料對(duì)纖溶酶的交換吸附效果較好。經(jīng)纖溶活性檢測(cè)，洗脫峰Ⅳ-2為活性峰，酶比活力為266.4IU/mL，選用此峰進(jìn)行下一步凝膠層析。

2.1.4 Sephacryl S-300HR凝膠層析

纖溶酶粗酶液經(jīng)過(guò)分段鹽析、疏水層析和陰離子交換層析后，已除去了大部分雜蛋白。Ⅳ-2樣品經(jīng)聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)，結(jié)果呈現(xiàn)3條帶，故采用Sephacryl S-300HR預(yù)裝柱進(jìn)行凝膠層析，作進(jìn)一步純化，結(jié)果見(jiàn)圖4。經(jīng)纖溶活性檢測(cè)，洗脫峰Ⅳ-2-2有活性，酶比活力為99.9IU/mL。

圖4 Sephacryl S-300HR凝膠層析圖譜Fig. 4 Sephacryl S-300HR chromatographic fractionzation of the fibrinolytic enzyme obtained from RESOURCEM Q chromatographic fractionization

2.1.5 SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量

對(duì)凝膠層析后得到的峰Ⅳ-2-2活性組分濃縮后，用SDS-PAGE測(cè)定其分子質(zhì)量。結(jié)果如圖5所示，峰Ⅳ-2-2樣品呈現(xiàn)單一條帶，為單鏈蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其分子質(zhì)量約為63kD。

圖5 純化的纖溶酶SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of the final purified product

2.1.6 HPLC純度鑒定

取峰Ⅳ-2-2組分用HPLC進(jìn)行純度鑒定(圖6)，結(jié)果為單一峰，說(shuō)明該成分為單一組分，純度為94.1%。

圖6 纖溶酶PPFE-I的HPLC純度分析Fig.6 Purity analysis of the final purified product by HPLC

2.1.7 纖溶酶PPFE-I分離純化效果

通過(guò)對(duì)多黏類芽孢桿菌EJS-3發(fā)酵液進(jìn)行了上述流程純化，獲得了較好的效果，見(jiàn)表1。

表1 纖溶酶PPFE-I的分離純化Table 1 Summarized results of Isolation and purification of PPFE-I from Paenibacillus polymyxa EJS-3

從表1可以看出，發(fā)酵上清液經(jīng)離心除菌、30%～70%硫酸銨分段鹽析、Hiprep phenyl FF疏水層析、RESOURCEM Q離子交換層析和Sephacryl S-300HR凝膠過(guò)濾等純化步驟，獲得分子質(zhì)量為63kD和純度為94.1%的組分的純酶PPFE-I，每升發(fā)酵液中可獲得1.6mg活性蛋白，每毫克蛋白活力達(dá)2096IU，純度提高了14.5倍，回收率為3.3%。

2.2 纖溶酶體外血凝塊的溶解作用

纖溶酶酶溶液對(duì)體外血凝塊的溶解作用如表2所示。當(dāng)纖溶酶酶溶液對(duì)血凝塊作用12h時(shí)，其對(duì)體外血凝塊的溶解率比對(duì)照組高55.88%，作用24h時(shí)，其對(duì)體外血凝塊的溶解率比對(duì)照組高71.93%，表明PPFE-I有明顯的體外溶栓作用。

表2 纖溶酶酶液體外對(duì)血凝塊的溶解率(x+s，n=3)Table 2 Thrombolytic effect of PPFE-I on blood coagulation in vitro(+s，n=3)

表2 纖溶酶酶液體外對(duì)血凝塊的溶解率(x+s，n=3)Table 2 Thrombolytic effect of PPFE-I on blood coagulation in vitro(+s，n=3)

注：*.與對(duì)照組比較，差異極顯著(P＜0.01)。

組別 溶解前血塊濕質(zhì)量/g溶解后血塊濕質(zhì)量/g 溶解率/%酶液(12h) 0.3404±0.1026 0.1079±0.0383 68.58±2.09*酶液(24h) 0.3624±0.1154 0.0302±0.0043 91.33±1.53*對(duì)照組(12h) 0.3134±0.1106 0.2735±0.0961 12.70±1.05對(duì)照組(24h) 0.3202±0.0914 0.2580±0.0728 19.40±1.39

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)生多黏芽孢桿菌纖溶酶的分離純化及其體外溶栓作用進(jìn)行了研究。通過(guò)硫酸銨分段鹽析、Hiprep phenyl FF疏水層析、RESOURCEM Q離子交換層析和Sephacryl S-300 HR凝膠過(guò)濾，獲得電泳純的多黏芽孢桿菌纖溶酶(PPFE-I)，每升發(fā)酵液中可獲得1.6mg活性蛋白，每毫克蛋白活力達(dá)2096IU，純度提高了14.5倍，回收率為3.3%。SDS-PAGE測(cè)定PPFE-I的相對(duì)分子質(zhì)量為63kD，與王光利等[27]報(bào)道芽孢桿菌纖溶酶相同，卻與以往報(bào)道的不同。Li等[28]從中藥絡(luò)石的組織中篩選到一株Verticillium sp. Tj33，并從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出一種活性較強(qiáng)的纖溶酶，分子質(zhì)量為31kD。Mitsuhiro等[29]從芙蓉屬的植物組織中篩選到一株具有較強(qiáng)纖溶活性Fusarium sp. BLB，經(jīng)發(fā)酵純化得到分子質(zhì)量為27kD的纖溶酶。Wu等[30]從Fusarium sp.CPCC480097的發(fā)酵產(chǎn)物中純化得到一種新型的纖溶酶(Fu-P)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)該酶分子質(zhì)量為28kD。

在酶的分離純化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生多黏芽孢桿菌纖溶酶包含一組同工酶。Hiprep phenyl FF疏水層析分出了幾個(gè)活性峰，除了酶活力很高的主要峰外，個(gè)別次要峰也顯示了較弱的纖溶活性。這說(shuō)明多黏芽孢桿菌ESJ-3發(fā)酵液中可能含有多種纖溶活性蛋白，只是同工酶的纖溶活性強(qiáng)弱不同。而從Hiprep phenyl FF疏水層析得到的主要活性峰，再通過(guò)RESOURCEM Q離子交換層析和Sephacryl S-300HR凝膠過(guò)濾，獲得其中分子質(zhì)量為63kD組分的纖溶酶PPFE-I。

為了明確纖溶酶PPFE-I溶栓作用，通過(guò)體外血凝塊的溶解作用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)PPFE-I酶溶液對(duì)血凝塊作用24 h時(shí)，其對(duì)體外血凝塊的溶解率91.33%，表明PPFE-I有明顯的體外溶栓作用，直接溶解作用的結(jié)果。盡管該酶在體外表現(xiàn)了較強(qiáng)的溶栓活性，但其在機(jī)體內(nèi)活性程度的情況，還有待于進(jìn)一步藥理學(xué)方面的研究來(lái)證實(shí)。

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Purification and Thrombolytic Effect in vitro of a Novel Fibrinolytic Enzyme Produced by Endophytic Bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3

Q939.93

A

1002-6630(2010)15-0231-05

2010-04-19

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z309)；江蘇省高新技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(BG2007335)；

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008308)

呂鳳霞(1963—)，女，副教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn

*通信作者: 陸兆新(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品微生物與生物技術(shù)研究。E-mail：fmb@njau.edu.cn