羅春萍，高金燕，胡純秋，陳紅兵,*，閆 飛

(1. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

花生過敏原Ara h 6的分離純化及鑒定

羅春萍1,2,3，高金燕4，胡純秋1,2，陳紅兵1,2,*，閆 飛2,3

(1. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

為高效分離純化花生過敏原Ara h 6，通過脫脂、蛋白浸提、陰離子交換層析分離得到目的蛋白，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)及免疫印跡技術(shù)(Western blotting)對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，該蛋白為花生過敏原Ara h 6，其分子質(zhì)量約為15kD，純度大于95%，得率為22.5%。該方法簡單、高效，可為花生過敏的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

花生過敏；Ara h 6；分離純化

Abstract ：In order to effectively isolate and purify peanut allergen Ara h 6, peanut was subjected to a series of sequential treatments, namely de-fatting, protein extraction and anion-exchange chromatographic. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis (SDS-PAGE), matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and Western blotting were used for the identification of target protein. The results indicated that the purified target protein was peanut allergen Ara h 6 with a molecular weight of 15 kD. The purity of Ara h 6 was more than 95%, and the recovery rate was 22.5%. Based on these investigations, a simple and efficient approach to purifying Ara h 6 is achieved, which will provide experimental materials for further research on peanut allergy.

Key words：peanut allergy；Ara h 6；isolation and purification

Ara h 6是花生中的過敏原之一，屬于2S白蛋白家族，與花生主要過敏原Ara h 2的氨基酸序列有59%的同源性[1]。Ara h 6約占花生蛋白總含量的4.5%[2]，其分子質(zhì)量約為15kD，等電點(diǎn)為5～6[3]。近年來，Ara h 6蛋白在花生過敏反應(yīng)中的重要作用得到越來越多的關(guān)注，因而獲得高純度的具有天然活性的Ara h 6蛋白將為其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究提供必不可少的材料。迄今為止，Suhr[3]、Marsh[4]和Koppelman[5]等用陰離子交換層析結(jié)合凝膠層析或高效液相色譜等技術(shù)分離了Ara h 6，而只用陰離子交換層析法分離純化Ara h 6的方法尚未見報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)以花生為研究對(duì)象，采用DEAESepharose Fast Flow陰離子交換法分離純化得到高純度的花生過敏原Ara h 6，并通過SDS-PAGE電泳、MALDITOF/MS質(zhì)譜和Western blotting鑒定，旨在為進(jìn)一步開展花生過敏原Ara h 6的結(jié)構(gòu)與功能等研究提供良好的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮花生 市購；DEAE-Sepharose Fast Flow GE公司；牛血清白蛋白(電泳純) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究院；兔抗花生過敏原Ara h 6多克隆抗體 實(shí)驗(yàn)室自制；HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG二抗 Sigma公司；其他常用生化試劑均為分析純。

PB-10型pH計(jì) 德國Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī) Backman公司；蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng) 上海青浦滬西儀器廠；迷你型蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像儀 Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分離純化與鑒定工作流程圖

1.2.2 花生蛋白的粗提

參照Koppelman等[5]和Bernard等[6]的方法對(duì)花生進(jìn)行粗提。

1.2.2.1 花生脫脂

新鮮花生剝殼去紅衣，用液氮研磨成細(xì)粉末。將花生粉末與丙酮溶液按1:5(m/V)混合，磁力攪拌(4℃)脫脂2h后，4℃、9000r/min離心15min，棄上清，將該沉淀反復(fù)脫脂3次，冷風(fēng)吹干后得脫脂花生粉末。

1.2.2.2 花生蛋白浸提

將脫脂花生粉末與Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.2)按1:5(m/V)混合，磁力攪拌(4℃)10h后，4℃，9000r/min離心15min，取上清，并收集沉淀。向沉淀中加入Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.2)反復(fù)浸提兩次，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 離子交換層析分離純化花生過敏原Ara h 6

參照張英坤等[7]的方法采用陰離子交換樹脂DEAESepharose Fast Flow(2.0cm×30cm)進(jìn)行分離純化。用Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.2)平衡柱子，待柱子平衡后，加入12mL花生粗蛋白溶液，并用Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.2)進(jìn)行洗脫，洗脫至基線后改用含0～0.2mol/L NaCl的Tris-HCl溶液(50mmol/L，pH7.2)連續(xù)梯度洗脫。流速為1.5mL/min，分別收集洗脫峰部分，4min/管，紫外吸收法測定A280nm，檢測蛋白質(zhì)。

1.2.4 分離純化蛋白的純度鑒定

采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白的純度鑒定[8]。將收集所得的蛋白溶液分別取樣，與等體積2×上樣緩沖液混合制成電泳樣品，采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳，使用5%濃縮膠和15%分離膠。電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。Quantity one軟件灰度掃描分析蛋白純度。

1.2.5 花生過敏原Ara h 6的質(zhì)譜鑒定

將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，將目的條帶割下，加入滅菌蒸餾水，密封，冷凍保存。送至暨南大學(xué)生命與健康工程研究院功能蛋白質(zhì)中心進(jìn)行MALDI-TOF/MS質(zhì)譜鑒定。

1.2.6 花生過敏原Ara h 6的血清學(xué)鑒定

采用Western blotting鑒定。純化的Ara h 6蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用1% TBST室溫封閉1h，加入1:5000(V/V)稀釋的抗花生過敏原Ara h 6的血清，4℃反應(yīng)過夜；用TBS洗膜后加1:5000(V/V)稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG二抗，室溫反應(yīng)2h，洗膜后加顯色液4-氯-1-萘酚顯色即可。

1.2.7 花生過敏原Ara h 6得率的測定

參照Folin-酚法[9]測定分離所得的蛋白樣品濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算Ara h 6蛋白的得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生蛋白粗提物的電泳分析

圖1 花生蛋白粗提物SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of the first, second and third extraction products of crude peanut proteins

花生仁經(jīng)粉碎、脫脂、浸提等操作后獲得花生粗蛋白溶液，脫脂花生粉末經(jīng)3次浸提后所得蛋白粗提物的SDS-PAGE電泳圖見圖1。粗提物中主要為Ara h 1～3和Ara h 6，其中Ara h 3的含量最高，其次是Ara h 1，Ara h 6的含量比Ara h 2略低。比較脫脂花生粉末反復(fù)浸提的結(jié)果可知，對(duì)該花生粉末經(jīng)3次提取即可提取花生中的大部分蛋白。第1次提取的粗提物中花生蛋白的含量非常低，這可能是由于花生中存在某種物質(zhì)抑制了花生蛋白的提取，且該抑制物溶于Tris-HCl溶液，經(jīng)離心后可被除去。

Ara h 6在花生蛋白中的含量較低，本實(shí)驗(yàn)采用多次浸提方法可使原料的利用率提高。且在整個(gè)粗提過程中未使用變性劑，始終保持低溫的條件，均可使蛋白保留天然活性。此外，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花生粗蛋白溶液經(jīng)反復(fù)凍融后，其濃度明顯降低。這是因?yàn)榛ㄉ鞍字饕獮橘A藏蛋白，易發(fā)生凝聚現(xiàn)象。因此，花生蛋白粗提后應(yīng)盡快用于離子交換層析，盡量減少因凝聚而導(dǎo)致其可溶性蛋白含量降低。

2.2 離子交換層析分離純化花生過敏原Ara h 6

圖2 陰離子交換層析分離花生過敏原Ara h 6Fig.2 Anion-exchange chromatographic profile of peanut allergen Ara h6 extract on DEAE-Sepharose Fast Flow column and SDS-PAGE of 7 resultant fractions

在pH7.2的條件下，花生蛋白中的一些堿性蛋白質(zhì)帶正電荷，不能被DEAE-Sepharose Fast Flow柱吸附而直接被洗脫下來，如圖2a峰1所示，該蛋白為分子質(zhì)量小于14kD的小分子蛋白。Ara h 6等酸性蛋白質(zhì)，在該pH值條件下帶負(fù)電荷，可被DEAE-Sepharose Fast Flow 柱吸附。蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)不同，與樹脂的結(jié)合力也不同，隨著NaCl離子強(qiáng)度的增加，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫下來，其洗脫曲線見圖2a。其中圖2a峰2在NaCl離子強(qiáng)度為0.05mol/L時(shí)被洗脫下來，SDSPAGE電泳檢測為目標(biāo)蛋白花生過敏原Ara h 6(如圖2b峰2)，其分子質(zhì)量約為15kD，與Koppelman等[5]分離的Ara h 6的分子質(zhì)量相同，灰度掃描該蛋白純度大于95%(圖略)。

在洗脫過程中隨著NaCl離子強(qiáng)度的增加，繼Ara h 6后出現(xiàn)的第3個(gè)峰即為花生過敏原Ara h 2，SDS-PAGE電泳檢測為分子質(zhì)量約為18kD和20kD的兩個(gè)條帶(圖2b)，灰度掃描該蛋白純度約為85%。Ara h 6與Ara h 2的氨基酸序列有59%的同源性，它們的某些性質(zhì)非常相似，兩者的分離純化是研究的一個(gè)難點(diǎn)，Marsh等[4]曾用反相高效液相色譜法分離Ara h 6和Ara h 2。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，簡單的陰離子交換法即可分離這兩種蛋白，且兩者的純度都較高。

在NaCl離子強(qiáng)度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，峰4和峰5被洗脫下來，SDS-PAGE電泳檢測為花生過敏原Ara h 1，其中灰度掃描峰5的蛋白純度約為80%。而在以往的分離Ara h 6的研究中，Suhr等[3]和Koppelman等[5]均先用凝膠層析法除去Ara h 1和其他一些雜蛋白，再用陰離子交換法來純化Ara h 6粗品。本實(shí)驗(yàn)所用的分離方法既得到了目的蛋白Ara h 6，又可得到純度較高的花生主要過敏原Ara h 1，方法更簡單，分離所得的蛋白種類更多。

峰6和峰7含有大量的花生過敏原Ara h 3，該粗品可用于Ara h 3的進(jìn)一步分離純化。從離子交換層析的洗脫曲線可以看出，花生過敏原與陰離子交換樹脂DEAE-Sepharose Fast Flow的結(jié)合能力由弱到強(qiáng)依次為Ara h 6、Ara h 2、Ara h 1、Ara h 3。本實(shí)驗(yàn)采用改變鹽濃度而不是去改變pH值的方法來進(jìn)行梯度洗脫，因?yàn)辂}濃度更容易控制，在實(shí)驗(yàn)中利用恒流泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中的鹽濃度平衡地上升，該方法的重現(xiàn)性非常好。

2.3 花生過敏原Ara h 6的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

圖3 花生過敏原Ara h 6的質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-TOF-MS spectrum of peanut allergen Ara h 6

MALDI-TOF/MS是通過肽質(zhì)量指紋譜結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜尋以分析蛋白質(zhì)序列而進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，該質(zhì)譜操作簡便、靈敏度高，同許多蛋白分離方法相匹配，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中有充足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因而被廣泛用于分析鑒定未知蛋白質(zhì)[10]。本實(shí)驗(yàn)將分離所得目標(biāo)蛋白進(jìn)行胰蛋白酶酶解后，用MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析獲得了一個(gè)一級(jí)質(zhì)譜圖(圖3)和7個(gè)二級(jí)質(zhì)譜圖(圖略)。根據(jù)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore軟件(軟件版本號(hào)：V3.6，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行分析，分析后的每一個(gè)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個(gè)文件，使用MASCOT(軟件版本號(hào)：V2.1，英國Matrix Science公司)搜庫軟件對(duì)NCBlnr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)純化所得的蛋白與花生過敏原Ara h 6相匹配，匹配度為100%，該過敏原在NCBlnr數(shù)據(jù)庫中的序列號(hào)為gil75114094，分子質(zhì)量為16.9kD，等電點(diǎn)為6.13，肽段序列比對(duì)結(jié)果見表1。本實(shí)驗(yàn)在用SDS-PAGE電泳對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，通過MALDI-TOF/MS質(zhì)譜鑒定進(jìn)一步證明了該蛋白為花生過敏原Ara h 6。

表1 花生過敏原Ara h 6質(zhì)譜鑒定肽段序列比對(duì)結(jié)果Table 1 Identification of peptides in peanut allergen Ara h 6 by mass spectroscopy

2.4 花生過敏原Ara h 6的Western blotting分析

Western blotting鑒定蛋白質(zhì)是根據(jù)被測蛋白能否與特異性抗體結(jié)合的特性和該蛋白的分子質(zhì)量，該方法具有高效、簡便、靈敏等特點(diǎn)，是檢測樣品中是否存在蛋白抗原的一種可靠方法[11]。本實(shí)驗(yàn)將純化所得的目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，與SDSPAGE電泳相對(duì)應(yīng)的Ara h 6組分的泳道在分子質(zhì)量約15kD處出現(xiàn)單一的條帶，如圖4所示。說明兔抗花生過敏原Ara h 6抗體可以特異性地識(shí)別Ara h 6，并且與其他蛋白條帶無特異性的識(shí)別，進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)分離得到了高純度的花生過敏原Ara h 6。

圖4 花生過敏原Ara h 6的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of peanut allergen Ara h 6

2.5 花生過敏原Ara h 6的得率

花生過敏原Ara h 6約占花生總蛋白含量的4.5%[2]，目前報(bào)道的該蛋白的純化方法均比較復(fù)雜，很難計(jì)算Ara h 6的得率或其得率很低。因此，關(guān)于純化所得花生過敏原Ara h 6蛋白的得率尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以Ara h 6占花生總蛋白含量的4.5%為依據(jù)計(jì)算經(jīng)分離所得的Ara h 6的得率，陰離子法分離得到的花生過敏原Ara h 6的蛋白含量及得率如表2所示。結(jié)果表明，該陰離子交換法分離所得的Ara h 6的得率為22.5%。

表2 陰離子法分離得到的花生過敏原Ara h 6的得率Table 2 Recovery rate of Ara h 6 purified by anion-exchange chromatography

3 結(jié) 論

本研究選用新鮮花生為原料，采用陰離子交換法分離得到花生過敏原Ara h 6。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，目標(biāo)蛋白的分子質(zhì)量約為15kD，純度大于95%，且蛋白得率為22.5%。經(jīng)MALDI-TOF/MS質(zhì)譜和Western blotting進(jìn)一步鑒定該蛋白為花生過敏原蛋白Ara h 6。本實(shí)驗(yàn)所用方法的優(yōu)越性在于采用了簡單的離子交換層析法，得到了高純度的目標(biāo)蛋白。該方法簡單，易操作，成本低，實(shí)驗(yàn)所得高純度的花生過敏原Ara h 6可用于開展該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究。

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Purification and Identification of Peanut Allergen Ara h 6

LUO Chun-ping1,2,3，GAO Jin-yan4，HU Chun-qiu1,2，CHEN Hong-bing1,2,*，YAN Fei2,3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China；4. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TS201.21

A

1002-6630(2010)15-0076-04

2010-04-20

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200807)；

江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目([2004]234號(hào))；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-08-07-04)

羅春萍(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛庸すこ獭-mail：went_fly@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：chbgjy@hotmail.com