鄭振雨，荊 波，尹蕓生

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，山西太原 030001）

雙磷酸鹽已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床治療骨代謝疾病，目前大多數(shù)實驗已經(jīng)闡明唑來膦酸對破骨細胞的作用機制，但是最近有發(fā)生下頜骨壞死的報道，所以其對成骨細胞和成骨質(zhì)量的影響還存在爭議。成骨細胞以自分泌和旁分泌的方式產(chǎn)生IGF-1，它是促進骨合成代謝的主要細胞因子。本實驗擬通過觀察唑來膦酸對成骨細胞增殖和IGF-1表達的影響，進一步探討唑來膦酸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑及儀器 唑來膦酸（吉林省西點藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司）；IGF-1酶聯(lián)免疫試劑盒（美國安迪生物科技有限公司）；MTT（美國Sigma集團公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 成骨細胞培養(yǎng) 取新生24 h內(nèi)的雄性SD乳鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）6只。培養(yǎng)方法見參考文獻[1]。

1.2.2 實驗藥物的配制 唑來膦酸粉劑用PBS溶解，制成10-2mol/L作為儲備濃度，保存在-20℃冰箱中。用PBS稀釋，制成 含藥 濃度為 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L 的培 養(yǎng)基。對照組不加藥。

1.2.3 MTT法檢測成骨細胞增殖 取第三代成骨細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，改用含有唑來膦酸的DMEM培養(yǎng)基，樣本含量為10孔，7d 后，于培養(yǎng)終止前 4h 換液并加入 MTT（5g/L）20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩10 min，490 nm波長下測定個孔吸光度（OD值）。

1.2.4 ELISA檢測IGF-1含量 取第三代成骨細胞以每孔3×104個細胞接種于2塊24孔板內(nèi)，樣本含量為8孔，于第2天加入含有唑來膦酸的培養(yǎng)液，以后每2天半換液1次，7d時取上清液，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，并計算IGF-1的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 唑來膦酸對成骨細胞增殖的影響

唑來膦酸在較高濃度時（10-4mol/L和10-5mol/L）與對照組相比，成骨細胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而在較低濃度時（10-6mol/L和10-7mol/L），與對照組比較，成骨細胞減少不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 唑來膦酸對成骨細胞IGF-1表達的影響

唑來膦酸濃度在10-4、10-5mol/L時IGF-1表達水平低于對照組（P＜0.01）；在濃度為 10-6、10-7mol/L 時，IGF-1 的表達量與對照組相差不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。量與對照組相差不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 不同濃度唑來膦酸對成骨細胞增殖（OD值）的影響（±s）Tab.1 Effects of Zeladronate on proliferation(OD value)of osteoblasts(±s)

表1 不同濃度唑來膦酸對成骨細胞增殖（OD值）的影響（±s）Tab.1 Effects of Zeladronate on proliferation(OD value)of osteoblasts(±s)

與對照組相比，*P<0.01，**P>0.05Compared with controlgroup,*P<0.01,**P>0.05

樣本量OD值濃度 10-4mol/L 10-5mol/L 10 0.050 ±0.004*10 0.515 ±0.077*10-6mol/L 10 1.293 ±0.138**10-7mol/L 10 1.305 ±0.174**0（對照組）10 1.261 ±0.136

表2 唑來膦酸成骨細胞分泌IGF-1的影響（±s）Tab.2 Effects of Zeladronate on expression of IGF-1 in osteoblasts(±s)

表2 唑來膦酸成骨細胞分泌IGF-1的影響（±s）Tab.2 Effects of Zeladronate on expression of IGF-1 in osteoblasts(±s)

與對照組相比，*P<0.01，**P>0.05Compared with controlgroup,*P<0.01,**P>0.05

樣本量IGF-1（μg/L）濃度 10-4mol/L 10-5mol/L 8 11.35 ±3.32*8 20.63 ±5.13*10-6mol/L 8 156.75 ±20.94**10-7mol/L 8 161.31 ±18.57**0（對照組）8 163.17 ±13.26

3 討論

雙磷酸鹽被廣泛應(yīng)用于臨床治療骨代謝疾病，例如骨質(zhì)疏松、Paget病和轉(zhuǎn)移性骨癌[2]。雙磷酸鹽能促進破骨細胞凋亡[3]，但是最近有使用唑來膦酸后發(fā)生下頜骨壞死的報道。所以唑來膦酸對成骨細胞和成骨質(zhì)量可能也有影響。IGF-1是促進骨合成代謝的主要細胞因子[4]，并且是骨骼中最豐富的生長因子[5]，它能作用于骨質(zhì)疏松骨愈合的全過程[6]。Hock等[7]研究也發(fā)現(xiàn)IGF-1作用于顱蓋骨后，膠原合成增加。

本實驗結(jié)果表明，①唑來膦酸濃度≥10-5mol/L時，IGF-1表達降低，可能是由于其細胞毒性作用引起的。Pan等[8]的報道稱，盡管會減少成骨細胞數(shù)量，但是高濃度的唑來膦酸（5～25）×10-6mol/L還是會增加人成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的形成。所以，成骨細胞的增殖與礦化關(guān)系可能不是那么密切相關(guān)。另外，彭晨等[9]的研究顯示，唑來膦酸在低濃度時不影響增殖和分化，這支持臨床使用低濃度的唑來膦酸。②唑來膦酸濃度在≥10-5mol/L時，抑制成骨細胞增殖，濃度越大，抑制作用越明顯。Orriss等[10]研究表明唑來膦酸濃度≥10-9mol/L時對破骨細胞抑制明顯。因此，推測該藥對破骨細胞的抑制效果比成骨細胞更敏感。這更支持臨床使用較低濃度的唑來膦酸。由于在骨微環(huán)境中唑來膦酸對成骨細胞的影響至今觀點仍不統(tǒng)一[11-12]，而且體內(nèi)成骨細胞可能較長時間地暴露于唑來膦酸，所以還需要對唑來膦酸的長期作用效果進行深入的研究。

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[7]Hock JM,Centrells M,Canalis E,et al.Insulin-likegrowth factor 1 has independent effects on bone matrix formation and cell replaction[J].Endocrinology,1988,122(1):254.

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[9]彭晨,王志強,李琪佳,等.唑來膦酸對大鼠成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2009,22(3):267-270.

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