王曉燕,李俊俊,楊云娟,唐湘華,孟艷芬,許波,黃遵錫

1(中國農(nóng)業(yè)大學水利與土木工程學院,北京,100193)

2(生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心,云南昆明,650092)

3(云南師范大學酶工程重點實驗室,云南昆明,650092)

4(云南師范大學生命科學學院,云南昆明,650092)

三株異淀粉酶酶源菌株的篩選分離及部分酶學性質(zhì)研究＊

王曉燕1-4,李俊俊2-4,楊云娟2-4,唐湘華2-4,孟艷芬2-4,許波2-4,黃遵錫1-4

1(中國農(nóng)業(yè)大學水利與土木工程學院,北京,100193)

2(生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心,云南昆明,650092)

3(云南師范大學酶工程重點實驗室,云南昆明,650092)

4(云南師范大學生命科學學院,云南昆明,650092)

從云南溫泉中分離鑒定了3株產(chǎn)異淀粉酶的芽孢桿菌,經(jīng)16Sr DNA序列比對分析及主要生理生化研究,初步鑒定為:Bacillus am yloliquefacieLCEP-1、Bacillus subtilisDL-3-4-2、Bacillus subtilisDMJS-2-1。GeneBank登錄號分別為:gb.GQ199589、gb.GQ199593、gb.GQ199594。3株菌所產(chǎn)的異淀粉酶都能降解玉米支鏈淀粉。酶解反應的最適pH分別為pH 6.8、5.4和pH 7.8;最適溫度分別為60、55、60℃。優(yōu)化條件下,最高酶活分別為:36.5、18.89、11.08μ/mL。3株菌的酶對不同金屬離子有不同的反應,金屬螯合劑EDTA對酶活又有較強的抑制作用,推測可能都屬于金屬酶。3株菌能在偏酸性至中性的pH范圍內(nèi)(pH 4.4～8.0)保持穩(wěn)定,可以在pH變化較大的條件下保持較高的酶活,在偏酸性、中性和弱堿性環(huán)境中都能有效地水解淀粉質(zhì)底物。3株菌所產(chǎn)異淀粉酶,底物專一性強,最適pH可低至5.4。

異淀粉酶,菌株篩選,酶學性質(zhì)

異淀粉酶(E.C.3.2.1.168,isoamylase)是內(nèi)切型淀粉酶,可專一性地切開支鏈淀粉分支點的α-1,6-糖苷鍵,形成直鏈淀粉,它只能水解構成分支點的α-1,6-糖苷鍵,不能水解直鏈分子中的α-1,6-糖苷鍵的特性,早期主要應用于淀粉、糖原及其水解產(chǎn)物和其他有關化合物分子結構的理論研究[1]。近年來,異淀粉酶廣泛應用于酶制劑領域并成為食品工業(yè)的加工助劑[2]。自然界中,異淀粉酶來源廣泛。目前已在水稻、玉米、馬鈴薯、蠶豆及擬南芥等許多植物中發(fā)現(xiàn)有異淀粉酶(R-酶)[3]。高等動物的肝臟、肌肉中也有類似于異淀粉酶的水解α-1,6-糖苷鍵的酶存在。1940,日本學者首次從酵母細胞提取液中發(fā)現(xiàn)異淀粉酶[4],后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),有不少細菌和某些放線菌均能產(chǎn)生異淀粉酶[5-6],但能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的菌種還是比較難得。

王弋博[7]等人誘變中溫地衣芽孢桿菌,其出發(fā)菌株的異淀粉酶活達到3.35μ/mL,誘變后酶活提高到7.37μ/mL;夏靜[8]等人從云南梁河溫泉水樣中分離篩選到1株產(chǎn)異淀粉酶的棲熱菌(Thermus),其產(chǎn)酶的初始酶活達4.14μ/mL。王武[9]等對短桿菌異淀粉酶產(chǎn)生菌進行誘變、選育,從初始酶活為7μ/mL的出發(fā)菌I2,獲得了搖瓶發(fā)酵液中酶活單位最高可達520μ/mL的突變菌株,其酶作用最適pH低至pH 5.0,最適溫度高至55℃,是至今國內(nèi)較為優(yōu)良的產(chǎn)異淀粉酶菌株,但一直未其后續(xù)研究及工業(yè)化生產(chǎn)的報道。目前,只有丹麥的Novo公司具備淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)能力,我國工業(yè)所用異淀粉酶全部從Novo公司進口,價格昂貴,極大地限制了異淀粉酶在我國的應用。因此,如何降低酶成本,尋找一條國產(chǎn)化生產(chǎn)異淀粉酶的途徑,成為酶制劑行業(yè)努力的方向。

為了獲得性能更優(yōu)良的酶源菌,我們從云南全省各地溫泉、土壤中分離鑒定了數(shù)十株產(chǎn)異淀粉酶的菌株,其中3株芽孢桿菌:B acillus am yloliquefacieLCEP-1、B acillus subtilisDL-3-4-2、B acillus subtilisDMJS-2-1產(chǎn)異淀粉酶的初始酶活較高,本文對這3株菌產(chǎn)的異淀粉酶進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采自云南騰沖、洱源溫泉的水樣和土樣,共計100余份。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗儀器和主要藥品

儀器:722S型分光光度計,上海分析儀器總廠;VPL-1型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜,上海通特電訊設備廠;冷凍高速離心機,德國Eppendorf公司;S W-CJZFD凈化工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;精密pH儀,梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

主要藥品:支鏈淀粉(corn amylopectin),馬鈴薯淀粉(potato amylose)、普魯蘭糖、葡萄糖、麥芽糖均購自Sigma公司。

1.2.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L):支鏈淀粉1.0,蛋白胨0.1,酵母膏0.1,NH4NO30.1,K2HPO40.7,KH2PO40.3,MgSO4·7H2O 0.05,CaCl2·2H2O 0.05,pH 4.5。

初篩平板培養(yǎng)基A(g/L):支鏈淀粉0.5,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,KH2PO40.05,MgSO4·7H2O 0.01,CaCl2·2H2O 0.05,瓊脂2.5,pH5.0。

初篩平板培養(yǎng)基B(g/L):紅色普魯蘭糖0.3,蛋白胨0.5,酵母膏0.5,KH2PO40.05,MgSO4·7H2O 0.01,CaCl2·2H2O 0.05,瓊脂2.5,pH5.0。

斜面培養(yǎng)基(g/L):支鏈淀粉2.0,蛋白胨0.4,KH2PO40.1,MgSO4·7H2O 0.05,pH6.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨1.0,酵母膏0.5,NaCl 0.5,pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):支鏈淀粉2.0,蛋白胨0.5,酵母膏 0.5,KH2PO40.05,MgSO4·7H2O 0.01,(NH4)2SO40.1,CaCl2·2H2O 0.05,pH6.5。

測透明圈平板培養(yǎng)基(g/L):支鏈淀粉0.01,Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH值分別為pH 3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4),瓊脂2.5。

1.2.3 方法

1.2.3.1 菌種篩選方法

稱取土樣10 g至90 mL滅菌水中,加入滅菌玻璃珠,振蕩搖瓶10 min,靜置1 h后取土樣上清液100 μL于試管中(水樣直接取100μL),加入2 mL富集培養(yǎng)基,37℃富集培養(yǎng)16 h。將富集菌液做梯度稀釋,取適宜稀釋度涂布初篩平板A,分別置于50℃培養(yǎng)24 h,澆入Lugo碘液,挑取有藍色透明圈,且透明圈HC值較大的菌落,劃線分離、純化,50℃培養(yǎng)24 h后接入試管斜面。將純化菌種同時劃線于初篩平板B中,根據(jù)水解圈的有無判斷該菌是否產(chǎn)生普魯蘭酶,以此區(qū)別于產(chǎn)異淀粉酶的菌株。

1.2.3.2 菌株生理生化特征的鑒定

菌株的染色研究:篩選出的菌種劃板,在50℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24.48 h,然后挑取單菌落,進行細菌的簡單染色、革蘭氏染色、莢膜染色和芽孢染色。

菌株主要生理生化研究:篩選出的菌種劃板培養(yǎng)24 h,然后挑取單菌落,進行細菌的硝酸鹽還原試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、石蕊牛奶試驗、接觸酶試驗。

1.2.3.3 菌株的16sRNA序列分析:

CTAB/NaCl法[10]提取菌株總DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段長度。

16S rDNA擴增:

(1)細菌專一性16S rDNA引物,由TaKaRa公司合成,其序列為:

正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

反向引物:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

(2)16S r DNA PCR反應體系:50μL

(3)PCR擴增條件:94℃變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火90 s,72℃延伸150 s,30個循環(huán);72℃保溫20 min。

(4)16S rDNA PCR產(chǎn)物純化:用上海生工的SilverBeadsDNA膠回收試劑盒進行純化。

測序及分析:PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,與pMD-18-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α,陽性轉(zhuǎn)化子菌液送華大基因公司完成測序。采用BLASTN在Genbank中進行同源性比對分析。

1.2.3.4 菌株發(fā)酵培養(yǎng)方法

用牙簽挑取少許純化菌種接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶內(nèi),37℃,180 r/min,培養(yǎng)16 h,然后按20%比例轉(zhuǎn)接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶內(nèi)中,置于迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中進行好氧發(fā)酵,轉(zhuǎn)速200 r/min,37℃發(fā)酵48 h。

發(fā)酵液離心(10000 r/min,10 min),取上清液,(NH4)2SO4分級沉淀,測定酶活力變化,確定淀粉酶的(NH4)2SO4飽和度。(NH4)2SO4沉淀的酶,經(jīng)Na2HPO4-檸檬酸緩沖液透析,適當濃縮,用于酶學性質(zhì)研究。

1.2.3.5 異淀粉酶酶活的測定

[11],DNS法測定菌株酶學活性。

酶活定義:在最適條件下,每1 min產(chǎn)生相當于1 μmol葡萄糖還原力的酶活為1個單位(U)。

發(fā)酵時間對酶活力的影響:將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵液,于37℃分別發(fā)酵24、36、48、60、72、96 h,測定酶活力,確定最適發(fā)酵時間。

最適pH及pH對酶穩(wěn)定性的影響:用不同pH值(pH 3.2、3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0、8.5)的磷酸鹽緩沖液配制0.5%的底物(支鏈淀粉)溶液,測定酶活,確定最適pH值;將用上述不同pH值緩沖液配制的酶液在40℃分別放置1 h,然后測定剩余酶活力。

最適溫度及溫度對酶穩(wěn)定性的影響:用最適pH值的緩沖液配制0.5%的底物溶液,在不同的溫度(25、40、50、60、70、80、90℃)下測定酶活,確定酶促反應的最適溫度;將酶液分別在上述溫度下保溫30 min,然后在最適pH、最適溫度下測定酶活力。

金屬離子及EDT A對酶活力的影響:在酶液中分別添加各種金屬離子和EDT A,使反應液中各種金屬離子和EDT A的終濃度為1×10-2mol/L,室溫下放置30 min,以不加金屬離子和EDT A為對照(酶活力為100%),在最適pH值和最適溫度下測定殘余酶活力。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)異淀粉酶菌株的篩選

篩選到3株透明圈HC值較大的單菌落,編號LCEP-1,DL-3-4-3,DMJS-2-1,經(jīng)新平板上劃線分離、純化,甘油保種,-70℃保存。

2.2 菌株淀粉水解試驗

LCEP-1菌株最適生長溫度50℃,用Lugo碘液噴灑在測透明圈平板培養(yǎng)基上測透明圈HC=10;DL-3-4-3菌株最適生長溫度50℃,HC=7;DMJS-2-1菌株最適生長溫度37℃,HC>10(見圖1)。

圖1 三株菌在含1%玉米支鏈淀粉平板上產(chǎn)生的透明圈

2.3 菌株生理生化特征的鑒定

菌株的生理生化特征見表1、表2。

表1 菌落特征

表2 細菌的生理生化特征

2.4 菌株的16SrRNA序列分析

CTAB/NaCl法提取菌株總DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段長度大于15 kb。

用細菌特異性16S rDNA引物,擴增出約1.6kb的單一目的條帶(圖2)。

圖2 三株菌的16Sr DNA PCR產(chǎn)物約1.6 kb

16S rDNA序列同源性比對分析結果:

產(chǎn)異淀粉酶菌株LCEP-1、DL-3-4-3、DMJS-2-1的16S r DNA在Genbank中分別與B acillus am yloliquefaciensstrain SE-02 BCRC(AB201122)、B acillus subtilis strain ZJ06(Fu266071)、Bacillus subtilisstrain Pab02(EU346662)有99%、97%、99%的同源性,與這3株菌的進化關系較近。綜合形態(tài)鑒定及生理生化鑒定,初步將它們鑒定為B acillus am yloliquefaciens strain LCEP-1(gb.GQ199589)、Bacillus subtilisDL-3-4-3(gb.GQ199593)和 B acillussubtilisDMJS-2-1(gb.GQ199594)。

2.5 菌株的酶學性質(zhì)研究

2.5.1 發(fā)酵時間對酶活力的影響

由圖3知LCEP-1、DL-3-4-3、DMJS-2-1最適發(fā)酵時間為48,36、36 h。

2.5.2 酶作用的最適pH值

圖3 發(fā)酵時間-活力曲線

由圖4知,LCEP-1、DL-3-4-3、DMJS-2-1最適pH值分別為6.2、5.4、7.8。

圖4 pH-活力曲線

3株菌能在偏酸性至中性的pH范圍內(nèi)(pH值4.4～8.0)保持穩(wěn)定,可以在pH變化較大的條件下保持較高的酶活,在偏酸性、中性和弱堿性環(huán)境中都能有效地水解淀粉質(zhì)底物。

2.5.3 酶作用的最適溫度

由圖5知,LCEP-1、DL-3-4-3、DMJS-2-1酶的最適反應溫度分別為60、55、60℃;LCEP-1酶活力隨著溫度的升高而下降,70℃以上下降明顯。DL-3-4-3、DMJS-2-1在50～70℃間變化較緩慢。

圖5 溫度-酶活力曲線

2.5.4 金屬離子及EDTA對酶活力的影響

圖6 結果顯示,3株菌的酶對不同金屬離子有不同的反應,金屬螯合劑EDTA對酶活又有較強的抑制作用,推測可能都屬于金屬酶。

圖6 金屬離子對酶活的影響

Mn2+、Zn2+對LCEP-1酶活有微弱的激活作用;Pb2+、Fe3+、Cu2+、EDTA對酶活有顯著抑制作用;Hg2+對酶活完全抑制;而K+、Mn2+、Ca2+則對酶活影響不大。

Fe3+、Mn2+、Ca2+對DL-3-4-3酶活有微弱的激活作用;Pb2+、Fe3+、Cu2+對酶活有顯著抑制作用;EDTA對酶活有輕微抑制作用;Hg2+對酶活完全抑制;而K+、Zn2+、Ca2+則對酶活影響不大。

Zn2+、Mg2+、Ca2+對DMJS-2-1酶活有微弱的激活作用;Cu2+、Pb2+、Fe3+、Mn2+、K+、EDTA對酶活有顯著抑制作用;Hg2+對酶活完全抑制;其余則對酶活影響不大。

3 結論

本研究的3株芽孢桿菌的異淀粉酶最適pH分別為pH值6.8、5.4和pH值7.8;最適溫度分別為60、55、60℃,與文獻報道基本一致。3株芽孢桿菌對金屬離子的反應基本相符,但Hg2+的抑制作用非常敏感,酶活被完全抑制。B acillus am yloliquefacie LCEP-1、Bacillus subtilisDL-3-4-2、B acillus subtilisDMJS-2-1在含支鏈性淀粉的平板上50℃培養(yǎng)24 h,產(chǎn)生典型的變色透明圈;以普魯蘭糖為底物、DNS法測酶活,無活力;而以1%玉米支鏈淀粉(corn amylopectin,Sigma)為底物,用DNS法測酶活(測定條件:t:55℃,pH:5.0)酶活分別為:27.45、22.17、18.53μ/mL?？梢?3株菌所產(chǎn)異淀粉酶,酶系純,底物專一性強,最適pH可低至pH值5.4,具有良好的應用潛力。

后續(xù)工作將對該酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化、誘變育種,克隆和表達該淀粉酶基因,并對酶的應用價值進行更為深入的研究。

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ABSTRACTTo determine the physiological and biochemical characteristics,three B bacillusstrains were isolated from Yunnan springs and were identified by 16 SrDNA sequence analysis asBacillus am yloliquefacieLCEP-1,B acillus subtilisDL-3-4-2 and B acillus subtilisDMJS-2-1 with their GeneBank accession numbers of gb.GQ199589,gb.GQ199593 and gb.GQ199594,respectively.Isoamylases from all three strains could hydrolyze corn amylopectin.The optimal pH of enzymatic reaction respectively was 6.8,5.4 and 7.8;opt imum temperature was 60℃,55℃ a nd 60℃.Underoptimized conditions,the highest enzyme activitywas36.5 U/mL,18.89 U/mL and 11.08 U/mL.The enzymes react differently to metal ions.It isproposed that the three isoamylases belong tometal enzymes because some metal and EDTA showed stronger inhibitory effect than others on the enzyme activity.W ithin the pH range of 4.4～8.0 all three enzymes remain stable;the enzyme activities can maintain high under the condition ofweak acidic,neutral to weak alkaline.

Key wordsisoamylase,screening of strains,characterization

Isolation of ThreeBacillusStra ins and Characterization of Their Isoamylase

Wang Xiao-yan1-4,Li Jun-jun2-4,Yang Yun-juan2-4,Tang Xiang-hua2-4,Meng Yan-fen2,3,4,Xu Bo2-4,Huang Zun-xi1-4
1(College ofWater Conservancy and Civil Engineering,China AgriculturalUniversity,Beijing 100193,China)
2(Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomas Energy,Ministry of Education,Yunnan 650092,China)
3(The Key Lab of Enzymatic Engineering in Yunnan NormalUniversity,Yunnan 650092,China)
4(Life Science School of Yunnan NormalUniversity,Yunnan 650092,China)

在讀博士,副教授。

＊云南省應用基礎研究計劃重點項目:熱泉中高溫酶功能基因研究與評價(2006C004Z)

2009-12-08,改回日期:2010-01-23