張少麗 張魯剛 張明科 惠麥俠

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

大白菜溫度敏感雄性不育育性轉(zhuǎn)化相關(guān)XET基因的電子克隆

張少麗1，2張魯剛1*張明科1惠麥俠1

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

以從大白菜溫敏雄性育性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因差異表達(dá)的分析中獲得的 EST-58為標(biāo)簽，采用電子克隆的方法對(duì)其進(jìn)行延伸，并對(duì)電子克隆的結(jié)果進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明:電子克隆到1個(gè)由1197 bp核苷酸組成的序列，該序列具有完整的開放閱讀框架（ORF），編碼蛋白為292個(gè)氨基酸。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，連續(xù)樣品間EST-58表達(dá)的帶型變化趨勢(shì)與cDNA-AFLP的差異顯示情況一致，且RT-PCR獲得的序列與電子克隆的序列一致性達(dá)98 %。用該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastX同源性分析，確定該序列為大白菜的XET基因（GenBank登陸號(hào)為EU579461）。

大白菜；育性轉(zhuǎn)化；木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（XET）；電子克隆

全基因組測(cè)序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效的方法，因?yàn)榛蚪M中只有2 %的序列編碼蛋白質(zhì)（李剛 等，2000）。作為cDNA部分序列的表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，ESTs）已成為尋找未知功能新基因及克隆不同時(shí)空差異表達(dá)基因的重要途徑（李曉曉 等，2007）。通過(guò)mRNA差異顯示、代表性差異分析或cDNA-AFLP等方法獲得ESTs后，研究者們都迫切希望迅速克隆到其全長(zhǎng)cDNA序列，以便對(duì)該基因的功能進(jìn)行研究（李剛 等，2000）。電子克隆（In silico cloning）策略是近年來(lái)隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃的發(fā)展而興起的一門快速克隆基因部分乃至全長(zhǎng)的新技術(shù)（Gill & Sanseau，2000）。由于受到DNA序列資源的限制，該技術(shù)在植物中的應(yīng)用還比較少（李曉曉 等，2007）。

本試驗(yàn)在大白菜〔Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour）Olsson〕TsCMS7311育性轉(zhuǎn)化cDNA-AFLP研究的基礎(chǔ)上（張少麗 等，2008），采用電子克隆的方法，對(duì)獲得的大白菜TsCMS7311育性轉(zhuǎn)化相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽EST-58進(jìn)行序列延伸，并采用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，利用生物信息學(xué)的方法將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，得到大白菜XET基因的cDNA序列（GenBank登陸號(hào)為EU579461），為進(jìn)一步的功能及其與TsCMS7311育性轉(zhuǎn)化關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大白菜溫度敏感不育系（TsCMS7311）由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院白菜研究室選育并提供，該不育系對(duì)溫度敏感，屬于低溫可育類型，現(xiàn)蕾期經(jīng)低溫處理，育性可發(fā)生轉(zhuǎn)換（Zhang & Hao，2001）。

1.2 電子克隆的生物信息學(xué)策略及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)

利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行核酸序列電子克隆的基本思路（張成崗和賀福初，2002）:① 利用序列同源性比較軟件（如Blast軟件）將種子序列（待進(jìn)行電子延伸的序列）對(duì)庫(kù)檢索；② 從數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出全部相關(guān)序列；③ 對(duì)所有序列進(jìn)行片段整合分析（即Contig分析），形成新生序列（延伸后的序列）。隨后，將此新生序列作為種子序列重復(fù)進(jìn)行上述三步過(guò)程，直至新生序列不能夠被進(jìn)一步延伸為止。

所用數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件包括:NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，NCBI網(wǎng)站的同源性分析程序BLAST及ORF Finder查詢器，EST組裝軟件CAP3，序列編輯及校對(duì)軟件BioEdit，序列的多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析軟件DNAMAN等。

1.3 克隆方法

1.3.1 質(zhì)粒、菌株 質(zhì)粒PMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。菌株E. coli DH5α由農(nóng)業(yè)部西北園藝植物種質(zhì)資源與遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3.2 樣品準(zhǔn)備、RNA提取及雙鏈 cDNA的合成 將室溫（24 ℃左右）條件下生長(zhǎng)的剛現(xiàn)蕾的大白菜不育系置于溫度7 ℃左右、光照強(qiáng)度3000 lx的培養(yǎng)箱中處理9 d（Zhang & Hao，2001），然后將培養(yǎng)箱溫度調(diào)至24 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。從處理的第5天開始取樣，每天相同時(shí)間取≤1.0 mm的花蕾（包括生長(zhǎng)點(diǎn)），共取樣10次。

總RNA的提取采用博日生物技術(shù)公司生產(chǎn)的Bizol試劑盒，提取方法參照說(shuō)明書進(jìn)行?？俁NA中的痕量 DNA用 RQDNaseⅠ（TaKaRa公司，大連）進(jìn)行純化。cDNA第一鏈的合成采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司，大連）進(jìn)行，第二鏈的合成使用DNA polymeraseⅠ和RNase（TaKaRa公司，大連），具體操作依照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。雙鏈cDNA用苯酚/氯仿/異戊醇（25 V∶24 V∶1 V）溶液純化后溶于10～20 μL的ddH2O中，備用。

1.3.3 引物合成 根據(jù)電子克隆所得到的序列運(yùn)用OLIGO6.0結(jié)合PRIMER5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)引物:5’引物:5’-TTTGCGGATGACTTTAGG-3’；3’引物:5’-TCCCACCAGTTCTTTGGATTAG-3’；預(yù)擴(kuò)區(qū)間（170～812 bp）。

1.3.4 PCR反應(yīng)及片段回收測(cè)序 將提取的各時(shí)期RNA采用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢于1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳分析，切取目的片段并利用凝膠回收試劑盒（TiANgel Midi Purification Kit）進(jìn)行回收純化。純化了的DNA連接pMD18-T載體（TaKaRa公司，大連），轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α并進(jìn)行克隆，經(jīng)PCR檢測(cè)后將陽(yáng)性克隆送于生工生物工程（上海）有限公司采用M13正向、反向引物進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子克隆結(jié)果

首先以表達(dá)序列標(biāo)簽EST-58為種子序列，利用Blast軟件對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索；獲得與木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（XET）相似性較高的序列組 EST-58—Bra5050（EST-58代表種子序列編號(hào)，Bra5050代表GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中UniGene的編號(hào)），包含14個(gè)相關(guān)序列標(biāo)簽（ESTs），這14個(gè) ESTs均來(lái)自蕓薹屬的大白菜，登錄號(hào)分別為:CV433160、DN960868、DN961282、DN965906、EX028596、EX059229、EX076694、EX077722、EX079287、EX080597、EX082503、EX096959、EX117429、EX141348。將這些相關(guān)序列下載并用組裝軟件CAP3進(jìn)行組裝，得到一個(gè)新生contig序列；將此contig序列用BioEdit軟件進(jìn)行編輯和校對(duì)，最終得到長(zhǎng)為1197 bp的新生序列（圖1）。

圖1 大白菜EST-58電子克隆結(jié)果的閱讀框架分析

2.2 RT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)電子克隆的結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，以大白菜10個(gè)時(shí)期的微蕾cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果顯示（圖2），得到的片段與預(yù)計(jì)大小相符。另外，條帶在圖2中的表現(xiàn)與最初的cDNA-AFLP的差異顯示（圖3）情況一致，即1、9、10樣品中帶很弱，其他樣品條帶很亮（6樣品的cDNA可能發(fā)生了降解），帶型趨勢(shì)為:無(wú)→有→無(wú)。進(jìn)一步說(shuō)明得到的XET序列確實(shí)與溫敏大白菜育性的轉(zhuǎn)化有關(guān)。低溫處理5 d時(shí)，由于所取樣品的部分花芽分化于常溫生長(zhǎng)時(shí)已完成，這時(shí)花的育性轉(zhuǎn)化不徹底，表現(xiàn)出嵌合態(tài)，大白菜XET基因轉(zhuǎn)錄很弱（圖2、3的1泳道）；經(jīng)低溫誘導(dǎo)后，雄蕊育性轉(zhuǎn)化徹底，呈完全可育狀態(tài)，該基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)（圖2、3的2～8泳道），其中6～8泳道（第10～12天取樣）為溫度調(diào)至24 ℃時(shí)所取樣品的譜帶，此時(shí)雖然溫度升高，但由于幼蕾花芽分化在低溫時(shí)已形成，所以育性仍表現(xiàn)可育；當(dāng)育性再次回復(fù)到不育狀態(tài)時(shí)（溫度調(diào)至24 ℃的第4～5天），基因的轉(zhuǎn)錄也隨之減弱（圖2、3的9～10泳道）。

用pMD18-T載體克隆后測(cè)序，得到長(zhǎng)度為643 bp的序列，該序列與電子克隆結(jié)果相似性分析表明:兩者序列基本相符，一致性達(dá)98 %（圖4）。由此可斷定電子克隆結(jié)果是真實(shí)存在的。

圖2 大白菜EST-58電子克隆結(jié)果的RT-PCR驗(yàn)證

圖3 EST-58片段在10個(gè)樣品中的 cDNA-AFLP差異顯示結(jié)果

圖4 RT-PCR序列測(cè)定結(jié)果與電子克隆結(jié)果一致性比較

2.3 將RT-PCR擴(kuò)增序列替代電子克隆結(jié)果的相應(yīng)序列后進(jìn)行閱讀框分析

應(yīng)用NCBI的ORFfinder工具在所得序列中查找開放閱讀框（圖1）。該閱讀框編碼292個(gè)氨基酸，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。-3位為A，+4位為G，符合Kozak規(guī)律，3’端有polA尾，說(shuō)明該讀碼框是完整的。

2.4 序列同源性分析

將RT-PCR測(cè)得的序列結(jié)合電子克隆結(jié)果，在GenBank中進(jìn)行氨基酸同源性分析，結(jié)果表明:得到的大白菜（B. pekinensis）XET與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、棉（Gossypium hirsutum）、雜種大丁草（Gerbera）、雜種山楊（Populus tremula）、波旁月季（Rosa borboniana）、截形苜蓿（Medicago truncatula）、番茄（Lycopersicon esculentum）、香蕉（Musa acuminata）、日本柳杉（Cryptomeria japonica）的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）有著很高的氨基酸序列一致性。氨基酸序列長(zhǎng)度也基本相同，進(jìn)一步證實(shí)所得序列為一個(gè)完整的基因。從同源蛋白檢索的結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)有大白菜XET序列的報(bào)道，說(shuō)明EST-58延伸得到的完整序列是大白菜中的一個(gè)新基因，即大白菜XET基因。另外，不同植物間XET氨基酸序列的N-端差異很大，而C-端具有較高的保守性。

從構(gòu)建的XET系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出（圖5），大白菜 XET與同為十字花科的擬南芥的一致性最高，達(dá)到94 %；而與大白菜親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種如日本柳杉、雜種山楊等也有較高的相似性，說(shuō)明XET基因保守性很強(qiáng)。

圖5 木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

與傳統(tǒng)獲得基因全長(zhǎng)的RACE技術(shù)及全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)篩選等方法相比，電子克隆技術(shù)具有高效、快速、成本低、針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)利用此技術(shù)對(duì)大白菜XETcDNA序列進(jìn)行了成功的克隆。但由于dbEST中EST數(shù)據(jù)不夠精確，精確度最高為97 %，所以獲得的序列只是一種模擬序列，其真實(shí)性還需要RT-PCR驗(yàn)證。為了提高電子克隆的準(zhǔn)確性，在實(shí)際操作中應(yīng)注意，將種子序列進(jìn)行同源檢索、連接時(shí)，應(yīng)盡量選擇親緣關(guān)系近的物種，以避免序列的錯(cuò)誤連接。

用特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆得到長(zhǎng)642 bp的序列，該序列與電子延伸相應(yīng)序列一致性達(dá)98 %，這可能是由物種間基因的差異或是dbEST中EST數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確性造成的。在進(jìn)行同源比較分析基因功能時(shí)，蛋白質(zhì)序列之間在至少80個(gè)氨基酸左右的區(qū)域中具有25 %同源性，就可提示其功能的相似性（張成崗和賀福初，2002）。本試驗(yàn)所得cDNA序列同源蛋白分析顯示，其與擬南芥XET全序列（293 aa）的一致性高達(dá)94 %，故可以斷定該序列對(duì)應(yīng)的蛋白為大白菜木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）蛋白。

木葡聚糖是雙子葉植物細(xì)胞初生壁的主要半纖維素多糖，它緊密地結(jié)合到纖維素的微纖絲上，并通過(guò)束縛相鄰的微纖絲，對(duì)細(xì)胞壁的膨脹起限制作用。木葡聚糖/微纖絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是維持植物細(xì)胞初生壁伸展性和強(qiáng)度所必須的，XET可以改變木葡聚糖/微纖絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛和細(xì)胞擴(kuò)展。所以說(shuō)XET是一類重要且與細(xì)胞伸長(zhǎng)密切相關(guān)的細(xì)胞壁松弛酶，它對(duì)細(xì)胞壁的膨脹疏松及在細(xì)胞壁重建中發(fā)揮著重要作用（王旭靜 等，2005；朱明月 等，2005；趙云峰 等，2006）。XET不僅具有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移作用，而且還具有解聚和水解的功能，XET在果實(shí)成熟衰老過(guò)程中的作用首先是使連接纖維素微纖絲間的木葡聚糖鏈解聚，進(jìn)而使木葡聚糖鏈發(fā)生不可逆的破裂（趙云峰 等，2006）。XET在細(xì)胞伸長(zhǎng)過(guò)程中扮演著重要角色，它調(diào)節(jié)著細(xì)胞壁成分——木葡聚糖/微纖絲的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其活性與細(xì)胞、組織的伸長(zhǎng)呈正相關(guān)（王旭靜 等，2005）。細(xì)胞壁重建、改組在植物整個(gè)生命過(guò)程中占有一定的地位，它對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能起著重要的作用。低溫誘導(dǎo)后大白菜花蕾的XET活性增強(qiáng)，孢母細(xì)胞壁組建正常，雄蕊育性表現(xiàn)正常；反之，則不能形成正?；ǚ哿！Ｖ劣跍囟热绾握T導(dǎo)XET基因，而XET基因在大白菜育性轉(zhuǎn)化中又起什么樣的作用，有待進(jìn)一步研究。

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In silico Cloning of Xyloglucan Endotransglycosylase（XET）Gene Related to Fertility Changeover in the Thermo-sensitive Chinese Cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）

ZHANG Shao-li1,2, ZHANG Lu-gang1*, ZHANG Ming-ke1, HUI Mai-xia1
（1College of Horticulture, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling712100, Shaanxi, China;2Vegetables Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou730070, Gansu, China）

The EST-58 related to the fertility changeover in the thermo-sensitive CMS（TsCMS7311）of Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）was amplified by in silico cloning. And the cDNA sequence had been confirmed by RT-PCR. The result indicated that a new sequence with1197 bp length was cloned，which contained an integrated ORF, encoding292 amino acids.The trend of EST-58 expression by RT-PCR was very identity to the expression by cDNA-AFLP, and their sequences have98 % consistency. As showed that the result of in silico cloning was right. The amino acid sequence showed highly comparability with xyloglucan endotransglycosylase（XET）fromgenBank. It indicated that the new sequence was XET gene（GenBank accession, EU579461）of Chinese cabbage.

Chinese cabbage; Fertility changeover; Gene of xyloglucan endotransglycosylase（XET）; In silico cloning

Q785

A

1000-6346（2010）24-0019-06

2010-09-16；接受日期:2010-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（30871717），國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2009BADB8B03）

張少麗，女，博士，助理研究員，專業(yè)方向:蔬菜育種，E-mail:shanpengzsl@yahoo.com.cn

*通訊作者（Corresponding author）:張魯剛，男，博士，教授，專業(yè)方向:蔬菜種植資源與育種，E-mail:lugangzh@163.com