李武峰,岳文斌

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷030801)

在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞線粒體里的三羧酸循 環(huán)和電子傳遞系統(tǒng)中,復(fù)合體II,即琥珀酸泛醌氧化還原酶(Succinate-ubiquinone oxidoreductase),又稱為琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase),是一個(gè)重要的酶復(fù)合體。SDHD,即琥珀酸脫氫酶復(fù)合體亞基D(Succinate dehydrogenase complex,subunit D)是復(fù)合體II的四個(gè)亞基(SHDB,SDHC,SDHD和 fumarate hydratase)之一,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些亞基基因的突變與人類的良性腫瘤易患家族有關(guān)[1]。

Khatib已經(jīng)證實(shí)牛SD HD等位基因的表達(dá)廣泛地存在于從牛的胎兒期至成年期的組織中[2]。

Zhu等,從中國(guó)通城豬 55天胎兒背最長(zhǎng)肌cDNA文庫中獲得一個(gè)SDHDcDNA序列。從中尋找了 SNP后,并進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,他們認(rèn)為SDHD基因型顯著與眼肌面積相關(guān)(p＜0.05)[3]。

Guimaraes等人的研究認(rèn)為,SDHD作為生產(chǎn)性狀潛在的一個(gè)候選基因是由于其在有氧呼吸過程和三羧酸循環(huán)中所扮演了一個(gè)關(guān)鍵的角色。他們?cè)谏唐坟i群體的背最長(zhǎng)肌中檢測(cè)了SDHDmRNA的表達(dá)水平,尋找到3個(gè)SNP,并與豬的生長(zhǎng)性狀、胴體性狀和肉品質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析[4]。

本項(xiàng)研究的目的是為了獲取山羊SDHD基因的mRNA序列信息,為進(jìn)一步研究山羊與肉品質(zhì)性狀的關(guān)系打基礎(chǔ)。本項(xiàng)研究是對(duì)山羊SDHD基因的首次研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究用肝臟和肌肉組織采自黎城種羊場(chǎng)青山羊作為實(shí)驗(yàn)材料。剛屠宰的羊,取肝臟和肌肉組織小塊用鋁箔紙包裝后,置-196℃液氮凍存。用TRIzol法從肝臟和肌肉組織中提取總RNA[5]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

選取人(NM_003002)、綿 羊 (NM_001078653)、牛(FJ495085)和豬(NM_001097516)的SDHD基因mRNA序列,利用lasergene 7軟件中的SeqMan功能合成一段包含保守片段的序列,并以此序列作為模板設(shè)計(jì)引物。

再利用Primer3在線設(shè)計(jì)山羊SDHD基因mRNA序列的特異引物。檢查引物的序列落在保守片段內(nèi),以保證擴(kuò)增的成功。本研究用來分離基因片段的引物見表1,引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成。

表1 用于分離和定位山羊的SDHD基因的引物序列Table1 Sequences of primer sets for SDHD geneisolation and mapping

1.3 cDNA第一鏈的合成

以前述獲得的肝臟和肌肉總RNA為模板,利用TaKaRa RNA PCR試劑盒(Ver.3.0)合成cDNA的第一鏈。10 L反應(yīng)體系:MgCl22 L,10×RT buffer 1 L,RNase Free d H 2O 3.75 L,dNTP Mixture 1 L,RNase Inhibitor 0.25 L,AMV Reverse Transcriptase 0.5 L,Oligo d T-Adaptor 0.5 L,總RNA 1 L。反應(yīng)條件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min,共一個(gè)循環(huán)。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

以已經(jīng)合成的 cDNA第一鏈為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,總的反應(yīng)體系為50 L,其中5×buffer 10 L,10μmol· L-1dNTPs 1 L,10 mol· L-1上游、下游引物各0.5 L,模板 cDNA第一鏈2 L,TaKaRa Taq HS聚合酶0.25 L,超純水25.75 L。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;然后94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸 1～1.5 min,40～42個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 產(chǎn)物的純化、克隆、鑒定和測(cè)序

產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含有目的片段的凝膠,放入1.5 mL的離心管中,然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa)純化PCR產(chǎn)物,按照試劑盒說明書操作。

連接反應(yīng):將用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化的RT-PCR產(chǎn)物與p MD-19T載體連接。

轉(zhuǎn)化:在5 L的連接產(chǎn)物中加入200 L制備好的感受態(tài)細(xì)胞,混勻,在冰上放置30 min,42℃熱激90 s,其間不要搖動(dòng)離心管,取出后冰浴5 min,加入800 L無 Amp抗生素的 LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng) 45 min,4 000 r·min-1離心 2 min以收集細(xì)胞,在無菌條件下去掉800 L上清液,用余下的200 L液體LB培養(yǎng)基重懸菌液,涂布于已提前涂布了IPTG和X-gal的瓊脂平板上,37℃平放30 min后倒置培養(yǎng)過夜。挑取平板上的白斑單菌落,接種于1～1.5 mL含Amp抗生素的液體LB培養(yǎng)基中,37℃300 r·min-1培養(yǎng)過夜。菌液送北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR產(chǎn)物

用設(shè)計(jì)的4對(duì)引物分別對(duì)山羊肝臟和肌肉總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,所得RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖1、圖2和圖3。

圖1 S1引物的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of primer S1.

圖2 S2引物的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products of primer S2.

圖 3 S3和S4引物的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of primer S3 and S4.

2.2 三段RT-PCR產(chǎn)物的陽性克隆、測(cè)序及拼接

由于在PCR擴(kuò)增中,Taq酶大多在擴(kuò)增產(chǎn)物的3'-末端非特異性地加上單一的核苷酸A。根據(jù)這一特性,本研究采用TaKaRa公司的pMD-19T載體,快速克隆PCR產(chǎn)物。這種載體兩端特定地加上一個(gè) T,這樣既可以防止載體的自身環(huán)化,又為PCR產(chǎn)物提供配對(duì)堿基,有效地提高了克隆效率。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌(JM 109)經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后,證明為陽性克隆的菌液送北京優(yōu)博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1、圖 2和圖 3 中的 451 bp、420 bp、529 bp和698 bp條帶,經(jīng)同源比對(duì)都為目的序列。

所獲得的四段序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)Lasergene7.0軟件SeqMan拼接后,獲得一條1238 bp長(zhǎng)度的序列。

在肝臟和肌肉組織中所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相同。說明在山羊SD HD基因mRNA在這兩種組織中沒有發(fā)生選擇性剪接,是相同的轉(zhuǎn)錄本。

2.3 山羊SDHD基因cDNA編碼序列分析

測(cè)序獲得的山羊SDHD基因1238 bp cDNA編碼序列片段,在 GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST/nr比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與綿羊相應(yīng)序列相似性最高可達(dá)98%(NM_001078653),與牛 97%(FJ495085),與豬相應(yīng)序列相似性達(dá)85%(NM_001097516),與人相應(yīng)序列相似性達(dá)81%(NM_003002)。

利用人的SDHD基因mRNA結(jié)構(gòu)作為參考,可以將山羊SDHD基因mRNA序列劃分為4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。

用NCBI的ORF Finder軟件對(duì)已經(jīng)克隆的山羊SDHD基因cDNA進(jìn)行開放閱讀框分析,發(fā)現(xiàn)該序列包含一個(gè)480 bp的開放閱讀框,兩翼有28 bp的5'非翻譯區(qū)和730 bp的3'非翻譯區(qū)。開放閱讀框編碼159氨基酸殘基,計(jì)算機(jī)分析表明(Compute p I/Mw tool),該蛋白的分子量約為17224.11Da,等電點(diǎn)為8.92。通過DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn),山羊SDHD蛋白保守性很高,其與綿羊(Q5G2C6)、牛(ACL82856)、豬(AAW29970)和人(AAH 70307)SDHD蛋白在氨基酸序列上的相似性分別達(dá)到 97%、96%、87%和 85%(圖4)。根據(jù)SDHD蛋白在氨基酸序列的相似性,用 Lasergene7.0軟件繪制了該蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),結(jié)果表明,親緣關(guān)系較近的物種先聚在一起。

圖4 山羊SDHD蛋白與人、牛、綿羊和豬蛋白氨基酸序列的比對(duì)分析Fig.4 Multiple alignment of the SDHD of goat with those of human,cows,sheep and pigs in amino acids sequences

圖5 SDHD蛋白的系統(tǒng)聚類樹Fig.5 Phylogenetic tree of the SDHD protein

利用NCBI/CDD對(duì)該蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)山羊SDHD蛋白含有一個(gè)CybS標(biāo)志性功能區(qū),位于第60～157氨基酸殘基。模式圖見圖6。

圖6 SDHD蛋白CybS功能區(qū)分布及其三維模式圖Fig.6 Three-dimensional ideograph of CybS domain distribution in SDHD protein

3 討論

由于Guimaraes等(2007)[4]的研究認(rèn)為豬的SDHD基因可以作為研究豬肉品質(zhì)性狀的候選基因,因此,我們也希望研究山羊SDHD基因作為山羊肉品質(zhì)性狀的候選基因。但是,在NCBI的GenBank中查不到任何山羊SDHD基因的序列作為研究參考,因此,我們首先對(duì)山羊SD HD基因mRNA全序列進(jìn)行了分離克隆,并對(duì)其序列進(jìn)行了相應(yīng)的分析。

首先利用幾個(gè)親緣關(guān)系較近物種的同源的序列,構(gòu)建一段包含若干保守片段的序列。然后利用此虛擬序列進(jìn)行同源引物的設(shè)計(jì)。在此項(xiàng)研究中,共設(shè)計(jì)得到4對(duì)引物。

然后利用分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手段,從肝臟和肌肉組織中的總RNA,分別克隆了山羊SD HD基因mRNA 的451 bp、420 bp、529 bp和 698 bp四段段序列,測(cè)序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件拼接后,結(jié)果獲得了2條完全相同的1238 bp長(zhǎng)度的序列。

此山羊SDHD基因cDNA序列已于2010年1月31日登錄在NCBI的GenBank上,登錄號(hào)為GU338978。

此480 bp的開放閱讀框編碼159氨基酸殘基。

此山羊SD HD蛋白質(zhì)序列也于2010年1月31日登錄在 NCBI的 GenBank上,登錄號(hào)為ADB92501。

本項(xiàng)研究為進(jìn)一步研究山羊的SDHD基因作為山羊肉品質(zhì)性狀候選基因,提供了相應(yīng)的序列信息。

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