郝曜山,杜建中,孫毅

(山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,山西 太原 030031)

近年來(lái),基因工程的蓬勃發(fā)展為花卉品質(zhì)的基礎(chǔ)研究和育種帶來(lái)了全新的思路和途徑。人們將所鐘意的特性的有關(guān)外源基因利用各種基因工程手段轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞獲得再生植株,以期獲得帶有目的性狀的轉(zhuǎn)基因花卉新品系[1]。蝴蝶蘭(Phalaenopsis)作為在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)最受歡迎的花卉之一,近年來(lái)市場(chǎng)需求持續(xù)上升,世界各國(guó)均對(duì)蝴蝶蘭的快速繁殖和新品種選育技術(shù)進(jìn)行廣泛、深入的研究[2]。

但由于蘭科植物同單子葉植物一樣對(duì)農(nóng)桿菌侵染不敏感,組織培養(yǎng)也有一定的難度,目前的轉(zhuǎn)化方法仍多采用粒子轟擊法[3]。筆者在本研究中通過農(nóng)桿菌侵染類原球莖體,并在侵染前后輔以超聲波及負(fù)壓處理,以gus為報(bào)告基因,用卡那霉素為篩選壓進(jìn)行選擇,獲得了轉(zhuǎn)化株,并初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭的遺傳體系。

1 材料和方法

1.1 受體材料

植物材料為蝴蝶蘭品系ΔB-5,由山西省農(nóng)科院園藝研究所提供。我們轉(zhuǎn)化所用的受體材料為其花梗腋芽在2/3MS培養(yǎng)基+6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2 g·L-1胰蛋白胨上于(25±3)℃,光照條件不超過2000 lx培養(yǎng)條件下所誘導(dǎo)的類原球莖 (PLB),最好繼代1～2次的材料。

1.2 供體材料

將所提取的質(zhì)粒pBI121通過熱擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。其中有在植物中篩選基因Nos-NPTⅡ和報(bào)告基因35S-gus。供試菌的轉(zhuǎn)化制備及質(zhì)粒的提取參考 《植物基因工程》[4]。

1.3 轉(zhuǎn)化方法及檢測(cè)

1.3.1 將附有質(zhì)粒p BI121的農(nóng)桿菌在含利福平(50 mg·L-1)和卡那霉素 (50 mg·L-1)的YEP液體培養(yǎng)基中,于28℃震蕩培養(yǎng)過夜,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期 (OD600=0.3～0.6),后在4000 g·min-1轉(zhuǎn)速、室溫下離心5 min收集菌體,并將菌體用重懸培養(yǎng)基懸浮 (OD600值在0.5左右),在侵染前向重懸液中加入乙酰丁香酮 (AS)100 μmol·L-1[5];

1.3.2 將PLB浸入無(wú)菌水中進(jìn)行超聲波處理,處理的參數(shù)為頻率25 k Hz,強(qiáng)度400 W,時(shí)間為100 s;將PLB取出浸沒在預(yù)先準(zhǔn)備好的菌液中,并在負(fù)壓50 k Pa壓力下侵染20 min左右;侵染結(jié)束后,用吸水紙快速吸凈PLB上多余的菌液,在超凈工作臺(tái)上將侵染過的PLB轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上,然后置于200～600 lx弱光照條件下繼續(xù)共培養(yǎng)3～4 d。

1.3.3 將共培養(yǎng)的PLB轉(zhuǎn)接到含200 mg·L-1頭孢的繼代培養(yǎng)基上,于1000～2000 lx光照下培養(yǎng)30 d后挑選新鮮的PLB轉(zhuǎn)移到500 mg·L-1卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上,繼代培養(yǎng)2～3代。

1.3.4 對(duì)存活的PLB進(jìn)行g(shù)us染色觀察統(tǒng)計(jì)[4];并將其接種到含有200 mg·L-1卡那霉素的生根培養(yǎng)基上;60 d后取其葉片進(jìn)行PCR檢測(cè) (提取DNA的方法為CTAB法,參照 《基因工程學(xué)原理》)[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭類原球莖繼代培養(yǎng)基條件優(yōu)化

具有高效穩(wěn)定的再生能力的受體材料是蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。由于在轉(zhuǎn)化過程中的一些處理,如農(nóng)桿菌侵染、超聲波負(fù)壓處理、機(jī)械損傷及抗生素的篩選都會(huì)使轉(zhuǎn)化的PLB比非轉(zhuǎn)化的PLB的再生頻率不同程度的降低[6,7],因此,PLB受體系統(tǒng)必須具有較強(qiáng)的再生能力,只有這樣,轉(zhuǎn)化的PLB才能進(jìn)一步脫分化和再分化。將蝴蝶蘭原球莖轉(zhuǎn)接在設(shè)置的培養(yǎng)基上,50 d后調(diào)查其生長(zhǎng)情況,結(jié)果見表1。

由表1可見,當(dāng)6-BA為3 mg·L-1、NAA為0.5 mg·L-1時(shí),蝴蝶蘭類原球莖具有較好的增殖效果,增殖系數(shù)達(dá)4.8。

另外,在筆者在研究中發(fā)現(xiàn),2/3MS培養(yǎng)基+2 g·L-1胰蛋白胨并輔以1000～2000 lx的光照培養(yǎng)條件下所誘導(dǎo)的類原球莖 (PLB)的再生能力較強(qiáng)。含1/3MS培養(yǎng)基+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+胰蛋白胨2 g·L-1+150 g·L-1的香蕉泥有利于蝴蝶蘭原球莖快速生根[8]。

表1 不同激素配比對(duì)蝴蝶蘭原球莖增殖的影響 (接種數(shù)均為30,其中增殖系數(shù)為增殖量/接種數(shù))Table 1 Effects of 6-BA and NAA on proliferation from Phalaenopsis PLB(Inoculant number:30;rate of proliferation=proliferation number/inoculant number)

2.2 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

從圖1可以看到蝴蝶蘭類原球莖在被OD600值為0.3菌液侵染后 gus轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)率最高,并在OD600值0.3～0.6之間的菌液侵染后gus轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)率差異不明顯,OD600值0.7之后呈快速下降趨勢(shì)。所以我們選用在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD600值為0.3～0.6的農(nóng)桿菌作為侵染體。

圖1 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.1 Effects of different bacterium concentrations onexpression of gus

2.3 超聲波及負(fù)壓處理對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

將在表2中不同處理的PLB在500 mg·L-1的卡那霉素條件下篩選30 d后進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)分析染色。在各個(gè)處理中均檢測(cè)到 gus的表達(dá),其染色陽(yáng)性率均達(dá)20%以上。而在侵染前進(jìn)行超聲波預(yù)處理,會(huì)很大程度上提高轉(zhuǎn)化效率。若侵染是在負(fù)壓下進(jìn)行,而沒有進(jìn)行超聲波預(yù)處理則轉(zhuǎn)化效率與對(duì)照相比略有提高。另外,我們發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理和在負(fù)壓下侵染二者之間存在交互影響,若同時(shí)處理將會(huì)更大程度上提高轉(zhuǎn)化效率。但是我們也發(fā)現(xiàn),超聲波與負(fù)壓處理與對(duì)照相比會(huì)大大降低PLB的生根與成苗的百分率,如何提高這兩種處理后PLB的生根和成苗率,有待進(jìn)一步的研究。

表2 不同處理對(duì)轉(zhuǎn)化的影響Table2 Effect of treatment methods on the transformation efficiency

2.4 蝴蝶蘭ΔB-5的PLB對(duì)卡那霉素的敏感性

將蝴蝶蘭 ΔB-5的PLB置于含100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1和500 mg·L-1卡那霉素的2/3MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)50～60 d。結(jié)果表明,蝴蝶蘭ΔB-5的PLB在卡那霉素濃度達(dá)到400 mg·L-1時(shí)仍有45%正常存活,在卡那霉素濃度達(dá)到500 mg·L-1僅有不到5%的存活率。試驗(yàn)證明蝴蝶蘭對(duì)卡那霉素具有較強(qiáng)的耐受性。固在其后的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中,我們選定500 mg·L-1卡那霉素濃度作為篩選濃度,以減少假陽(yáng)性抗性PLB及嵌合體PLB的獲得。

2.5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

處理的249個(gè)PLB經(jīng)過60～90 d的篩選培養(yǎng)后,共獲得69個(gè)卡那霉素抗性PLB(包括在篩選壓下新生的PLB),將其轉(zhuǎn)移至含1/3MS培養(yǎng)基+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+胰蛋白胨2 g·L-1+150 g·L-1香蕉泥+200 mg·L-1的卡那霉素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株再生,共獲得50株再生蝴蝶蘭 (其中有6株為叢生狀),3～4葉時(shí)取其部分頂端葉片提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)分析。其中有17株呈陽(yáng)性,在對(duì)照植株中未擴(kuò)增出此條帶 (見圖2)。

3 結(jié)論與討論

圖2 部分轉(zhuǎn)化植株的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR result of CaMV 35S from transformed Phalaenopsis.

目前,轉(zhuǎn)基因蝴蝶蘭選育大多采用原球莖,類原球莖,或非胚性愈傷組織為試材,采用原球莖,類原球莖作為受體材料雖然繼代培養(yǎng)相對(duì)容易,再生能力強(qiáng),但由于未經(jīng)過中間的愈傷組織發(fā)生過程,而使得對(duì)選擇藥劑有抗性的再生材料所發(fā)育獲得的轉(zhuǎn)化株多為嵌合體[9];而采用非胚性愈傷組織雖然易獲得完全轉(zhuǎn)化株,但蝴蝶蘭非胚性愈傷組織在固體培養(yǎng)基上易白化死亡,浸染后存活率較低,且長(zhǎng)成植株后其一些好的特性易發(fā)生改變[10]。這都使得蝴蝶蘭的基因轉(zhuǎn)化不易操作,在本研究中,筆者用蝴蝶蘭品系ΔB-5采用卡那霉素作為篩選元件,對(duì)蝴蝶蘭的類原球莖采用多次繼代選擇方法,有效控制了嵌合體的產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)趯?duì)蝴蝶蘭逐代繼代培養(yǎng)中用GUS檢測(cè)中也證實(shí)了這種情況。

另外,筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在農(nóng)桿菌侵染前使用低頻頻率為25 k Hz,強(qiáng)度為400 W的超聲波對(duì)待處理的PLB進(jìn)行預(yù)處理,可以大大提高蝴蝶蘭外源基因的轉(zhuǎn)化效率。這可能和超聲波的空化作用有關(guān),其有可能使得植物細(xì)胞處于一種類似感受態(tài)的狀態(tài),使得農(nóng)桿菌更易于侵染[11]。而在試驗(yàn)中侵染時(shí)被侵染對(duì)象處于負(fù)壓狀態(tài),與對(duì)照相比其侵染效率稍有提高。其原因可能是因?yàn)榕懦耸荏w材料表面的微小氣泡,使得菌液與受體材料能夠更充分地接觸,從而增加了對(duì)其的侵染機(jī)會(huì)。試驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn),這兩種處理方式同時(shí)使用時(shí)會(huì)更大程度上提高轉(zhuǎn)化率,說明兩者之間存在著一定的交互作用,其機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

蝴蝶蘭作為一種重要的觀賞花卉,建立成熟高效的轉(zhuǎn)化體系是十分必要的。本研究中通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭PLB過程中輔以一定強(qiáng)度的超聲波及負(fù)壓處理,并最終獲得了轉(zhuǎn)化株,為進(jìn)一步提高蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系和導(dǎo)入外源有益基因提供了理論依據(jù)。

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