葛志華 楊 寧 孫立新

野黃芩苷對(duì)內(nèi)毒素抑制人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

葛志華 楊 寧 孫立新＊

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院河北 067000)

目的 觀察野黃芩苷對(duì)內(nèi)毒素 (LPS)抑制人牙周膜細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的影響。方法 原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,采用酶動(dòng)力學(xué)方法觀察野黃芩苷對(duì)L PS抑制人牙周-膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響。結(jié)果 100μg/mL L PS可顯著抑制體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性。加入0.001-10μg/ml野黃芩苷干預(yù)后,對(duì)L PS抑制堿性磷酸酶活性有一定的拮抗作用,在1μg/ml時(shí)達(dá)到高峰。結(jié)論 野黃芩苷可能通過(guò)拮抗LPS抑制牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶的活性,促使牙周膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化而利于牙周組織再生修復(fù)。

野黃芩苷; 人牙周膜細(xì)胞; 內(nèi)毒素; 堿性磷酸酶

人牙周膜細(xì)胞 (human periodontal ligament cell,HPDLC)是牙周組織內(nèi)具有多向分化潛能的群體細(xì)胞,在維護(hù)牙周組織的健康中起著重要作用。LPS作為牙周病的主要致病物質(zhì),可使 HPDLC喪失多向分化的潛能,影響牙周組織的再生修復(fù)。目前,如何促進(jìn)牙周膜細(xì)胞向形成新牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)的方向分化從而形成新的牙周組織已成為牙周病研究的熱點(diǎn)之一。大量的研究報(bào)道,許多生物活性因子和中藥在誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞分化、促進(jìn)牙周組織修復(fù)的過(guò)程中都具有較好的作用。中藥野黃芩苷是從黃芩莖葉中提取的一種新的黃酮類化合物,現(xiàn)代藥理研究證實(shí)黃酮類化合物在抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗微生物和抗腫瘤等多方面都有一定的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察野黃芩苷對(duì)L PS抑制HPDLC的ALP活性的影響,探討其對(duì)牙周膜細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的作用,為臨床應(yīng)用于再生修復(fù)牙周組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.主要試劑和儀器

中藥野黃芩苷 (中國(guó)生物藥品檢定所),E.coliL PS(Sigma公司),DMEM培養(yǎng)液 (Gibco公司),胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS中美合資蘭州民海生物工程有限公司),Ⅰ型膠原酶(Bejing Biotechnology),胰蛋白酶 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司),青霉素、鏈霉素、兩性霉素B(華北制藥股份有限公司),SP免疫組化試劑盒、波形絲蛋白和角蛋白單抗 (北京中山生物技術(shù)公司),YT-CJ-1N型潔凈工作臺(tái) (北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心),倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus,日本),CO2孵箱 (SANYO日本),BIO-RAD伯樂(lè)680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó)),AL P試劑盒 (南京建成生物工程研究所),Triton X-100(北京化學(xué)試劑公司)。

2.主要溶液配制

野黃芩苷溶液的配制:取2mg野黃芩苷溶于2ml PBS中,Na HCO3調(diào)p H值至7.4,至野黃芩苷完全溶解,成為1mg/ml的儲(chǔ)存液,過(guò)濾除菌,用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋成所需濃度。

L PS溶液配制:取10mg L PS,用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基將其稀釋,振蕩,使充分溶解,并將其配成200μg/ml濃度,過(guò)濾除菌,備用。

3.牙周膜細(xì)胞的來(lái)源、培養(yǎng)和鑒定

選取承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科就診12-18歲青少年因正畸拔除的正常前磨牙,用含青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的DM EM培養(yǎng)液充分洗牙,用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織,0.2%Ⅰ型膠原酶搖床振蕩消化至大部分細(xì)胞游離、吹打、分散,加入少量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,離心,棄上清液,將細(xì)胞和組織收集到培養(yǎng)皿中,置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)成功后,常規(guī)換液,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取生長(zhǎng)良好的第3代HPDLC接種于蓋玻片上培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí),取出蓋玻片,常規(guī)固定,SP免疫組化法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白染色,光鏡觀察鑒定、攝影。

4.實(shí)驗(yàn)分組

分為3組:正常對(duì)照組,L PS組,野黃芩苷+L PS組,正常對(duì)照組DMEM培養(yǎng)液含2%FBS;LPS組DMEM培養(yǎng)液含2%FBS+LPS;野黃芩苷+L PS組的DM EM培養(yǎng)液含2%FBS+野黃芩苷+LPS,其中L PS的終末濃度為100μg/ml,野黃芩苷的終末濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml。

5.各實(shí)驗(yàn)組AL P活性的檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的第6代 HPDLC,調(diào)整細(xì)胞密度至3×104/ml,接種于24孔培養(yǎng)板,每孔接種細(xì)胞懸液1ml,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24h后棄去培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞,加入以上各組溶液1ml,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育3d后,每組取3孔作細(xì)胞計(jì)數(shù)。另外5孔用PBS洗 3遍,每孔加入 100μl 0.2%Triton X–100,置于4℃冰箱過(guò)夜。觀察無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,吹打混勻,取各孔液體50μl,按AL P試劑盒說(shuō)明按比例依次加入緩沖液、基質(zhì)液、顯色劑,酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)490nm,測(cè)各孔OD值,再根據(jù)每組細(xì)胞計(jì)數(shù)情況折算成1×105個(gè)細(xì)胞的OD值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或星形,胞突細(xì)長(zhǎng),胞體豐滿,胞質(zhì)均勻,核圓形或卵圓形者為牙周膜細(xì)胞 (圖 1)。

2.免疫組化鑒定

HPDLC經(jīng)免疫組化波形絲蛋白染色陽(yáng)性 (圖2),細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色著色;角蛋白染色陰性 (圖3),胞質(zhì)不著色,說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于中胚層。取免疫組化角蛋白陰性、波形絲蛋白陽(yáng)性的5-10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

圖1 倒置顯微鏡下 HPDLC形態(tài) (×200);圖2 波形絲蛋白染色陽(yáng)性 (SP法×200);圖3 角蛋白染色陰性 (SP法×200);Fig.1 HPDLCs in under phase-contrast microscope(×200);Fig.2 The positive expression of vimentin in plasma of HPDLCs(SP method×200);Fig.3 The negative expression of keratin in the plasma of HPDLCs(SP method×200)

3.ALP活性測(cè)定結(jié)果

從表1,圖4可以看出,100μg/ml L PS可顯著抑制ALP活性。加入不同濃度野黃芩苷后,對(duì)L PS抑制AL P活性有一定的拮抗作用,其中在0.1μg/ml時(shí)開始與LPS組有顯著性差異 (P<0.05),1μg/ml時(shí)達(dá)到高峰,與L PS組比較有極顯著性差異 (P<0.01)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組AL P活性的檢測(cè)結(jié)果Table 1 The ALP activity in each group

圖4 各實(shí)驗(yàn)組ALP活性的檢測(cè)結(jié)果圖Fig.4 The ALPactivity in each group

討 論

堿性磷酸酶 (ALP)作為一種成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶,是成骨代謝敏感而特異的指標(biāo)。研究表明,ALP在牙周組織有較強(qiáng)活性,并參與骨骼的鈣化、組織代謝和再生。人牙周膜細(xì)胞是一種具有多種生物學(xué)功能和分化潛能的細(xì)胞群,是牙周組織進(jìn)行再生修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn),HPDLC具有合成和分泌大量膠原和非膠原蛋白,表達(dá)較高AL P活性等生物學(xué)特征[2]。因此AL P活性高低可作為牙周膜細(xì)胞的骨化指標(biāo)之一,反映牙周膜細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)[3]。

LPS作為革蘭氏陰性菌中所獨(dú)有的一種致病物質(zhì),對(duì)牙周組織細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性和抗原作用,被認(rèn)為是牙周炎癥的重要病因之一,在牙周病的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。L PS作為牙周病的主要致病因子,對(duì) HPDLC細(xì)胞毒作用主要表現(xiàn)為:降低HPDLC的AL P活性,使其喪失向成骨樣細(xì)胞和成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞分化的潛能;抑制細(xì)胞的增殖;降低細(xì)胞的附著和定向移動(dòng)能力等[4,5]。我們的結(jié)果表明,加入100μg/ml LPS時(shí),能明顯抑制HPDLC的ALP活性,此結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[5],提示LPS可抑制 HPDLC成骨細(xì)胞樣特征,誘導(dǎo) HPDLC表型改變,使牙周膜不能進(jìn)行正常更新和改建,從而影響牙周組織的再生修復(fù)功能。目前,中藥對(duì)牙周組織再生修復(fù)的研究已越來(lái)越受關(guān)注。有研究報(bào)道[6,7],中藥如五倍子、黃芩、黃連、骨碎補(bǔ)等可提高 HPDLC的AL P活性,有促使人牙周膜細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的作用。本實(shí)驗(yàn)研究的野黃芩苷是從黃芩莖葉中提取的一種新的黃酮類化合物。已有研究證實(shí)[8],黃芩對(duì)常見牙周細(xì)菌有明顯的抑制作用,竇永青等[9]也發(fā)現(xiàn),從黃芩根中提取的黃芩苷有降解LPS的作用,并且這種作用具有濃度時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加入不同濃度的野黃芩苷對(duì)L PS抑制ALP活性有拮抗作用,該作用在野黃芩苷較低濃度0.001μg/ml、0.01μg/ml時(shí)不明顯,在 0.1μg/ml時(shí)開始顯效,并且在濃度為1μg/ml時(shí),作用達(dá)到最強(qiáng)。從而提示適當(dāng)濃度野黃芩苷在病變修復(fù)過(guò)程中,阻斷L PS抑制AL P活性,促使 HPDLC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而發(fā)揮修復(fù)牙周組織的作用。但野黃芩苷是否具有直接增強(qiáng)ALP活性,誘導(dǎo) HPDLC分化促進(jìn)牙周組織再生修復(fù)的功能,還需要進(jìn)一步的研究。

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EFFECTSOF SCUTELLARINON THE AL KALINE PHOSPHATASE ACTIVITY OF HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT CELLS INHIBITED BY LPS

Ge Zhihua,Yang Ning,Sun Lixin＊
(A f f iliated Hospital of Chengde Medical College;Hebei 067000,China)

Objective To investigate the effects of scutellarin on the alkaline p hosphatase activity of the human periodontal ligament cells inhibited by L PS.Methods Human periodontal ligament cells(HPDLCs)were primarily cultured in vitro.Enzyme dynamic methods were applied to observe the alkaline phosphatase activity of the human periodontal ligament cells.Results The alkaline phosphatase activity was remarkably inhibited by incubation of HPDLCs with 100μg/ml L PSof E.Coli and was improved in the presence of different concentrations of scutellarin f rom 0.001 to 10μg/ml,with the optimal effect at 1μg/mL of scutellarin.Conclusion Scutellarin may have the ability of promoting human periodontal ligament cells to transform into bone cells by blocking the inhibiting effects of LPSon the alkaline phosphatase activity of human periodontal ligament cells treated with LPS.

Scutellarin; Human periodontal ligament cell(HPDLC); LPS; Alkaline phosphatase

781.4

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.011

2009-12-15

2010-04-27

河北省中醫(yī)藥管理局2006計(jì)劃課題 (2006037)

葛志華,女 (1956年),漢族,教授,醫(yī)學(xué)博士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)