郭華雄鄧明鳳陳登峰張柳袁 璐劉 靜楊 勇徐正豐王昌富＊

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院1病理科,2中心實驗室,3乳腺科 荊州434020)

FISH和IHC檢測HER2基因及蛋白在乳腺癌診治中的應用

郭華雄1鄧明鳳2陳登峰3張柳1袁 璐1劉 靜1楊 勇1徐正豐3王昌富2＊

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院1病理科,2中心實驗室,3乳腺科 荊州434020)

目的 對比研究免疫組織化學(IHC)與熒光原位雜交(FISH)方法檢測乳腺癌中C-erbB-2蛋白表達和HER2基因擴增,評估兩種方法的實際應用價值。方法 IHC和FISH法分別檢測58例乳腺癌組織中C-erbB-2蛋白表達和HER2基因擴增狀況,并進行一致性分析。結果 IHC檢測蛋白陽性2+和3+共22例,占總病例的37.9%,58例乳腺癌中FISH檢測出HER2基因擴增17例,占29.3%。IHC檢測C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因擴增陽性,1例無擴增;C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可見HER2基因擴增;C-erbB-2蛋白1+者11例HER2基因擴增僅1例。C-erbB-2蛋白陰性病例共25例均未檢測到基因擴增。結果顯示IHC檢測C-erbB-2蛋白與FISH檢測 HER2基因擴增狀態(tài)有較高的一致性(k=0.681,P<0.01),C-erbB-2蛋白陰性和3+標本與HER2基因擴增陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例與其 HER2基因擴增差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 IHC檢測C-erbB-2蛋白強陽性(3+)和陰性(0)與 HER2基因擴增有較高的一致性,可作為臨床是否應用 Herceptin治療的依據,而C-erbB-2蛋白2+和1+病例必須進一步行HER2基因擴增檢測。

乳腺癌;HER2基因;蛋白;熒光原位雜交;免疫組織化學

原癌基因 HER2的蛋白表達產物是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白(p185),屬表皮生長因子受體家族成員,通過細胞間的信號傳導,調節(jié)細胞的增殖、分化和生長。目前研究表明,在乳腺癌中約有25%-30%的病例有HER2基因的擴增和蛋白的過度表達[1,2],HER2陽性乳腺癌患者的復發(fā)及轉移率高、預后不良,且常規(guī)化療效果不佳,而針對HER2陽性的分子靶向抗體赫賽汀(Herceptin)對乳腺癌有很好的療效,因此 HER2的檢測廣泛受到臨床和病理醫(yī)師的重視。目前常用的檢測方法有IHC和 FISH,但由于IHC檢測C-cerB-2陽性也并非代表的 HER2基因擴增[3],我們應用IHC和 FISH檢測乳腺癌中的 C-erbB-2蛋白及HER2基因表達狀況,分析二者之間一致性及實際應用價值,為乳腺癌的診斷與治療提供可靠依據。

材料和方法

1.材料:

58例乳腺癌為本院病理科2008年1月-2008年9月的活檢和手術切除標本,其中浸潤性導管癌54例,浸潤性小葉癌4例;所有病例均未行術前新輔助化療。

2.方法

2.1 制片:標本離體后立即固定于10%的中性福爾馬林中,固定時間8-24h,常規(guī)脫水包埋,以4μm厚度連續(xù)切片3張分別用于 HE染色、IHC和FISH檢測。

2.2 免疫組織化學(IHC):C-erbB-2一抗為即用型單克隆抗體(Lab Vision產品),MaxVisionTM快速法試劑盒購自邁新生物技術開發(fā)有限公司。常規(guī)切片、脫蠟入純水。組織切片放入p H6.0的檸檬酸緩沖液中,微波抗原修復,用PBS(p H7.4)洗片后入3%甲醇 H2O210min,充分洗滌后加入一抗4℃冰箱過夜,PBS充分洗片,切片滴加即用型 MaxVisionTM試劑,室溫孵育15min,洗滌后加DAB顯色液后顯微鏡下觀察信號并終止顯色,蘇木素襯染,脫水、透明、封固。已知陽性切片作陽性對照,PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

2.3 熒光原位雜交(FISH):GLP HER2/ CSP17探針試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。組織切片室溫下脫蠟,水化,酸性亞硫酸鈉50℃處理,蛋白酶 K37℃消化,HCl浸泡,-20℃梯度乙醇中脫水,室溫浸入丙酮固定,自然干燥玻片。55℃加熱玻片5-10min,變性液中浸泡5min,梯度脫水,將10μl變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域。封片后置于預熱的濕盒中,42℃保溫箱中過夜雜交16h。移去蓋玻片,立即將玻片分別置于50%甲酰胺/2×SSC、2×SSC 0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,70%乙醇浸泡3min后取出玻片,暗處自然干燥,將15μl DAPI復染劑滴加于雜交區(qū)域位置,覆以蓋玻片。暗處放置20min后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號。

2.4 結果判斷:

(1)IHC:參照美國臨床腫瘤協(xié)會/美國病理學家學院 HER2檢測指南評分系統(tǒng)[4]:浸潤性腫瘤細胞無著色為陰性(0),瘤細胞呈弱且不完整的胞膜著色或<10%瘤細胞呈較弱的胞膜染色為弱陽性(1+),≥10%瘤細胞有較弱但完整的胞膜著色或≤30%瘤細胞呈強且完整的胞膜著色為陽性(2 +),>30%腫瘤細胞呈較強的完整細胞膜染色為強陽性(3+)。

(2)FISH:在10/40倍物鏡下觀察信號,選擇細胞核大小一致、核的邊界完整、DAPI染色均一、細胞核孤立無重疊、綠色著絲粒信號清晰的區(qū)域,在100倍物鏡下,通過特異的單通道濾光片隨機計數(shù)30個細胞內信號。正常細胞:單個間期細胞核中紅色及綠色信號各2個。HER2基因擴增異常細胞:單個間期細胞核中紅色信號大于2個。Ratio值計算:Ratio值=30個細胞核中核中紅色信號總數(shù)/30個細胞核中綠色信號總數(shù),Ratio<1.8提示該樣本無 HER2基因擴增;Ratio>2.2提示樣本中 HER2基因擴增,若兩種信號的比值>20或眾多信號連接成簇時,可不用計算,即視為基因擴增;Ratio在1.8-2.2之間時,可以選擇增加計數(shù)細胞至100個,或者重新本次實驗來判斷最終結果。

3.統(tǒng)計學分析

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,FISH和ICH檢測方法采用kappa一致性檢驗分析;HER基因擴增與C-erbB-2蛋白表達陰/陽性率比較采用X2檢驗, P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.乳腺癌中HER2基因擴增及蛋白表達

C-erbB-2蛋白陽性信號位于細胞膜,HER2基因擴增為細胞核內紅色信號大于2個(圖1-4)。58例乳腺癌中 FISH檢測出 HER2基因擴增17例,占29.3%,IHC檢測 HER2蛋白有陽性信號者33例,占56.9%,其中陽性2+和3+共22例,占總病例的37.9%,C-erbB-2蛋白檢出率明顯高于HER2基因擴增。

2.HER2基因擴增與蛋白表達的相關性,見表1

本組IHC檢測C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因擴增陽性,1例無擴增,C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可見基因擴增,HER2蛋白1+者11例HER2基因擴增僅1例,C-erbB-2蛋白陰性病例共25例均未檢測到基因擴增。本組結果顯示IHC檢測C-erbB-2蛋白與FISH檢測HER2基因擴增狀態(tài)有較高的一致性且具有統(tǒng)計學意義(k=0.681,P=0.000);其中C-erbB-2蛋白陰性和3+病例與HER2基因擴增陰性和陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例與 HER2基因是否擴增(陰/陽性率比較)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 乳腺癌HER2/neu基因擴增與C-erbB-2蛋白表達的相關性Table 1 The correlation of Her-2 gene amplification and C-erbB2 protein in breast cancer

討 論

乳腺癌組織中有無 HER2基因擴增和蛋白過度表達,對于判斷患者的預后、預測臨床療效以及選擇使用赫賽汀生物靶向治療有重要意義,因此準確檢測HER2基因和蛋白狀況極為關鍵。

在多種檢測手段中,以IHC和FISH應用較多,FISH檢測目的物為相對穩(wěn)定的DNA,檢測過程較少受人為因素的影響,判讀標準客觀,可操作性強,特異性高,是檢測 HER2基因擴增的金標準[5],但因價格昂貴,且對實驗設備要求高,一般實驗室難以開展。而 IHC檢測物為CerbB-2蛋白,其特異性低于 FISH法,但卻有較高的敏感性,由于IHC方法固有的特點及制片效果、判讀因素使不同醫(yī)院間的結果差異較大。因此現(xiàn)在較多研究者認為對于IHC檢查C-erbB-2蛋白陽性患者均應行FISH復查[6,7]。本研究將IHC和 FISH方法進行對比分析,希望尋找到最合理的復查模式。

本組58例乳腺癌中有 HER2基因擴增者17例,檢出率為29.3%,我們的IHC和FISH實驗分別在兩個獨立實驗室完成,在各自實驗結束后才進行結果比對,在蛋白表達為0和3+的病例,其與FISH檢測結果的符合率分別達到了 100%(25/25)和91.7%(11/12),與國內外研究結果一致[8,9]。在C-erbB-2蛋白3+者12例中僅1例未發(fā)現(xiàn)相應的基因擴增,占無擴展病例的2.4%(1/ 41),在推測本例可能出現(xiàn)IHC結果假陽性時,也不能排除FISH實驗中偶爾產生的誤差情況。實驗表明這兩組病例IHC和FISH結果具有較高的一致性和吻合性(k=0.681,P<0.01),因此我們認為只要前期組織處理得當,IHC實驗嚴格質量控制,對于IHC檢測C-erbB-2蛋白陰性標本無需再做FISH檢測;而 IHC檢測C-erbB-2蛋白3+病例出現(xiàn)假陽性率極低,出于衛(wèi)生經濟學的觀點,一般情況下不必強調增做FISH檢查。

事實上IHC與FISH實驗結果對比主要集中在C-erbB-2蛋白表達1+和2+的病例,我們的這兩組病例C-erbB-2蛋白表達與 HER2基因擴增陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其結果的一致性和吻合性都存在明顯的差異,特別是2 +病例組的誤差達到了50%(5/10),與國內文獻報道C-erbB-2蛋白2+病例FISH陽性率為25%-76.19%結果一致[9,10]。因此我們認為這類病人必須增做FISH檢查(尤其是C-erbB-2蛋白表達2+的病例),以獲得準確的HER2狀況。

基于IHC和FISH法各自的特點,在乳腺癌病理診斷實際應用中將兩者結合,IHC作為主要的檢測手段,對于蛋白表達陰性或陽性3+者可直接報告臨床,作為 Herceptin分子靶向治療的依據,而對于蛋白表達1+和2+病例(特別是2+者)應進一步行FISH檢查,以明確是否有HER2基因擴增,為臨床判斷預后和選擇治療提供科學依據。

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圖 版 說 明

圖1 C-erbB-2蛋白1+,瘤細胞不完整的胞膜著色,IHC

SP法 ×400

圖2 C-erbB-2蛋白2+,<30%瘤細胞呈強且完整的胞膜著色,IHC SP法 ×400

圖3 C-erbB-2蛋白3+,多數(shù)瘤細胞呈強而完整的胞膜著色,IHC SP法 ×400

圖4 HER2基因擴增,瘤細胞核內紅色信號 >2個, FISH法 ×1000

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of C-erbB2 protein is positive.there is no tintegrity staining in the cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.2 Expression of C-erbB2 protein is moderately positive.There are strong and integrity staining in the cell membrane,but less than 30%.IHC S-P method ×400

Fig.3 Expression of C-erbB2 protein is strongly positive.There are strong and integrity staining of cell membrane.IHC S-P method×400

Fig.4 Her-2 gene amplication,the number of red signal in nucleus is more than two.FISH method×1000

DETECTIONOF HER-2 GENE BY FISHAN D IHC INDIAGN OSIS AN D TREATMENT OF BREST CANCER

Guo Huaxiong1,Deng Mingfeng2,Chen Dengfeng3,Zhang Liu1,Yuan Lu1,Liu Jing1, Yang Yong1,Xu Zhengfeng3,Wang Changfu2＊
(1Department of Pathology,2The Centre of laboratory,3Department of Breast,Institute of Jingzhou Hospital of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou434020,China)

Objective To compare the clinical significance between detecting C-erbB2 protein expression by immunohistochemistry(IHC)and detecting Her-2 gene amplification by flurescence in situ hybridization(FISH)in breast cancer.Methods The expression of C-erbB2 protein and Her-2 gene amplification in 58 cases of breast cancer were detected by IHC and FISH respectively,and the concordance between them was analyzed.Results Of 58 cases,the expression of C-erbB2 protein was strongly and moderately positive in 22 cases(37.9%),and the Her-2 gene amplification existed in 17 cases(29.3%).In 12 cases where the expression of C-erbB2 protein was strongly positive by IHC,Her-2 gene amplification exsited in 11 cases.In 10 cases where the expression of C-erbB2 was moderately positive,Her-2 gene amplification exsited in 5 cases.In 11 C-erbB2 weakly positive cases,Her-2 gene amplication exsited in only 1 case.But in 25 C-erbB2 negative cases,none was amplied.Those data showed good concordance between the two methods,(κ=0.681,P<0.01).In addition,for the cases with strongly positive or negative expression, the difference between IHC and FISH was not statistically significant(P>0.05),but for the cases with moderately and weakly positive expression,the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion There is favourable concordance between Her-2 gene amplification and strongly positive or negative c-erB2 expression.It can be a evidence to decide whether use herceptin in clinical therapy or not.But for the moderately and weakly positive cases,FISH must be applied.

Breast cancer;Her-2/neu;Protein;FISH;IHC

R737.9

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.008

2010-04-06

2010-05-05

衛(wèi)生部科研基金資助項目(WKJ2007-3-001)

郭華雄,男(1963年),漢族,主任醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)