羅欣 杜穎穎 張進(jìn) 馬端，2*

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 出生缺陷研究中心，上海 200032）

產(chǎn)前診斷是對(duì)胚胎或胎兒在出生前是否患有某些遺傳病或先天畸形做出準(zhǔn)確的診斷。目前采用的診斷方法多屬于有創(chuàng)性檢查，對(duì)妊娠婦女和胎兒都有一定的風(fēng)險(xiǎn)［1］。從妊娠婦女外周血中分離胎兒有核紅細(xì)胞（fetal nucleated red blood cells，F(xiàn)NRBCs）進(jìn)行基因分析已成為國(guó)內(nèi)外無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究熱點(diǎn)。但是母體循環(huán)中的FNRBCs數(shù)量稀少，難以達(dá)到臨床檢測(cè)的要求，高效富集FNRBCs方法已成為產(chǎn)前診斷中篩查染色體異常和基因異常的必要手段。本研究通過(guò)結(jié)合密度梯度離心和免疫磁珠分選的方法提高分選后FNRBCs的純度。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2007年5月至2008年3月在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院足月分娩的健康胎兒臍血5例，每例6ml，EDTA抗凝。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 密度梯度離心 用Ficoll（美國(guó)Sigma公司）制備密度1.119／1.107／1.077的三重梯度，每個(gè)梯度2ml，依次加入15ml離心管中。將血標(biāo)本：0.1MPBS=2：3（V／V）進(jìn)行稀釋，稀釋后的血標(biāo)本緩置于6ml密度梯度液上，室溫22℃，400g×40min。在1.077和1.107密度界面上，可見呈白膜狀的細(xì)胞層面。此層面即為富含單個(gè)核細(xì)胞，用槍頭輕輕插到此層，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入50ml管中，加入30ml PBS／1%BSA，300g×10min，棄上清，細(xì)胞沉淀再用相同的方法洗2次以去除殘留的密度梯度液，最后細(xì)胞沉淀重懸于300ul PBS／0.1%BSA中，吹勻。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取2ul重懸液加入198ul PBS中（即稀釋100倍），光鏡下計(jì)數(shù)4大格細(xì)胞數(shù)，重復(fù)1遍。8大格細(xì)胞數(shù)×100（稀釋倍數(shù)）×104=細(xì)胞數(shù)／ml。取106個(gè)細(xì)胞，用 PBS／0.1%BSA 補(bǔ)足80ul。

1.2.3 免疫磁珠分選 加入20ul CD71抗體磁珠（德國(guó)美天旎公司）4℃ 放置15min。300g×10min，棄上清，加入1ml PBS／0.1%BSA，重懸沉淀后，300g×10min，棄上清，沉淀重懸于500ul PBS／0.1%BSA。組裝美天旎磁珠分選系統(tǒng)。以500ul PBS／0.1%BSA潤(rùn)洗美天旎分選柱，待流空后，將分選的細(xì)胞上柱，收集流出液，標(biāo)記為陰性細(xì)胞。取500ul PBS／0.1%BSA潤(rùn)洗管子，待流空后再重復(fù)2次，最后。取500ul PBS／EDTA／BSA加入分選柱，待流空后再重復(fù)一次。最后取1ml PBS／0.1%BSA加入分選柱，拿離磁場(chǎng)，沖洗入15ml管內(nèi)，標(biāo)記為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.4 免疫熒光染色 分選前細(xì)胞、分選后的陰性細(xì)胞、陽(yáng)性細(xì)胞按1×105個(gè)細(xì)胞加入PE標(biāo)記的CD45單克隆抗體（德國(guó)美天旎公司）和FITC標(biāo)記的CD71單克隆抗體（德國(guó)美天旎公司）20μl，室溫避光孵育30min，PBS洗3遍，1%多聚甲醛固定。流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 涂片Wright's-Giemsa染色 同時(shí)取分選前細(xì)胞、密度梯度離心后細(xì)胞和分選后陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞涂片，涂片后先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋。稍等片刻待染液干后加吉姆薩染液1～2滴，用槍頭引導(dǎo)染色覆蓋涂膜面。等1～2min，再將PBS（PH6.4）一滴一滴地加到涂片膜上，直至膜面上染色液形成把表面張力而終止染色液進(jìn)入（PBS的用量為瑞氏吉姆薩染液之和的兩倍）。染色10min，分色，用自來(lái)水沖洗至顏色明顯變淡（3min），鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 CD71分選結(jié)果 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD71單克隆抗體磁珠用于臍血中胎兒有核紅細(xì)胞分選（CD71+，CD45-），分選后的純度可以達(dá)到81%，而分選前CD71陽(yáng)性細(xì)胞只占23.2%（圖1）。

BLANK001：無(wú)標(biāo)記的細(xì)胞，QIAN002：分選前細(xì)胞CD71和CD45雙標(biāo)記，HOU+004：分選后陽(yáng)性細(xì)胞CD71和CD45雙標(biāo)記，HOU-003：分選后陰性細(xì)胞CD71和CD45雙標(biāo)記。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 分選前臍血涂片可見大量的成熟紅細(xì)胞，有核細(xì)胞以淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，含少量有核紅細(xì)胞（圖2）。

2.2.2 三重密度梯度離心后取單個(gè)核細(xì)胞層，可見絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和有核紅細(xì)胞），含少量紅細(xì)胞（圖3）

圖1 CD71磁珠分選的結(jié)果

圖2 分選前的臍血涂片瑞式吉姆薩染色（×400）

圖3 三重密度梯度離心后細(xì)胞涂片瑞式吉姆薩染色（×400）

2.2.3 CD71單克隆抗體磁珠分選后陽(yáng)性細(xì)胞多為胞漿豐富略嗜堿性的有核紅細(xì)胞（圖4、圖5）。

圖4 分選后陽(yáng)性細(xì)胞瑞式吉姆薩染色（×400）

圖5 分選后陽(yáng)性細(xì)胞瑞式吉姆薩染色（×1000）

3 討論

早在1893年Schmorl［2］首先提出孕婦外周血中存在胎兒細(xì)胞，該觀點(diǎn)今年已經(jīng)被一些研究證實(shí)［3］。這就為非侵入性產(chǎn)前診斷提供了很好的理論依據(jù)。Lo等［4］研究表明母血中胎兒細(xì)胞數(shù)量隨孕周的增加而增加，且存在于整個(gè)孕期，使其成為很好的診斷材料。但是應(yīng)用孕婦外周血胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷已發(fā)展近20年，仍然因?yàn)榧夹g(shù)和價(jià)格的局限性不能廣泛在臨床中使用，因此高效富集母血中的FNRBCs已經(jīng)成為開展無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵。FNRBC是單核細(xì)胞，含有胎兒全部的遺傳物質(zhì)。它在孕婦外周血中的生存期比較短［5］，并且有區(qū)別于其他細(xì)胞的多種篩選標(biāo)記，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（CD71）、血栓敏感素受體（CD36）等。目前用于分選FNRBCs的方法主要有：密度梯度離心（DGC）、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分選法（FACS）、顯微操作發(fā)、免疫磁珠分離法、選擇性紅細(xì)胞裂解、凝集素富集法等。但是這些方法存在成本高或特異性不強(qiáng)等因素。雖然Bianchi等［6］研究表明FACS是迄今為止最佳分選富集胎兒細(xì)胞的方法，但FACS的缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴、操作步驟較復(fù)雜、可影響細(xì)胞的形態(tài)。本試驗(yàn)采用密度梯度離心和免疫磁珠分選相結(jié)合的方法，既可以排除密度梯度離心法獲得細(xì)胞數(shù)量少，純度不高且容易造成丟失的缺點(diǎn)［7］，又可以減少因?yàn)镃D71在母體淋巴細(xì)胞、成熟紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板表面也有一定程度表達(dá)造成的污染［8］。經(jīng)過(guò)對(duì)分選前后細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析技術(shù)和染色，此方法可以對(duì)臍血中FNRBCs進(jìn)行很好的分選，并達(dá)到比較理想的分選純度（81%）。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法可以運(yùn)用于分選孕婦外周血中的FNRBCs。

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［8］陳漢平，賀桂芳.孕婦外周血中胎兒細(xì)胞及胎兒DNA的檢測(cè)［J］.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2002，10：596-598.