徐 寧,孫樹剛,段舜山,李愛芬,張成武 (暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣東省教育廳水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

海洋微藻脲酶活性測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)研究

徐 寧*,孫樹剛,段舜山,李愛芬,張成武 (暨南大學(xué)水生生物研究中心,廣東省教育廳水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

為進(jìn)一步了解海洋微藻對(duì)尿素的吸收和利用機(jī)制,揭示水體尿素濃度升高對(duì)近海浮游植物群落演替的潛在影響及對(duì)近海有害藻類水華(HABs)形成的促進(jìn)作用,對(duì)海洋微藻脲酶活性的測(cè)定方法進(jìn)行了研究.以典型赤潮藻東海原甲藻為實(shí)驗(yàn)材料,在Peers方法的基礎(chǔ)上,探討了失活處理時(shí)間、提取液pH值、酶促反應(yīng)溫度以及微藻生長(zhǎng)階段對(duì)脲酶活性的影響.結(jié)果表明,失活處理時(shí)間、提取液pH值、酶促反應(yīng)溫度以及微藻所處的生長(zhǎng)階段都對(duì)微藻的脲酶活性具有顯著影響.海洋微藻脲酶活性的最佳測(cè)定條件為:100℃下失活處理時(shí)間 ＞ 2min;提取液pH值7.9;反應(yīng)溫度應(yīng)與微藻生長(zhǎng)溫度一致;指數(shù)生長(zhǎng)初期的藻體具有較高的酶活,而平臺(tái)期后酶活趨于穩(wěn)定.

微藻；脲酶活性；尿素；浮游植物；赤潮

Abstract：Assay optimization of urease activity in marine microalgae was studied in laboratory for further understanding the uptake and utilization mechanism of marine microalgae for urea and revealing effect of the increase of urea concentration for community succession of phytoplankton and its potential contribution to the formation of HABs in coastal waters. Based on Peers’ method, effect of inactivation time, pH value of the extract, incubation temperature and growth phase of microalgae on urease activity in a representative HABs species Prorocentrum donghaiense isolated from East China Sea were discussed. The results showed that inactivation time, pH value of the extract, incubation temperature and growth phase of microalgae all significantly influenced urease activity in microalgae. The optimum conditions for detecting urease activity in microalgae were: inactivation time ＞ 2min under 100℃, pH of extract 7.9, incubation temperature consistent with the growth temperature of the microalgae, urease activity in microalgae higher during early exponential phase and stabilized after stationary phase.

Key words：microalgae；urease activity；urea；phytoplankton；red tide

近年來,隨著全球有機(jī)氮肥使用量的不斷增加,大量尿素進(jìn)入近岸水體,成為溶解有機(jī)氮(DON)庫(kù)的重要組成成分.夏季尿素占DON的比例可達(dá)到40%～90%[1-2].研究顯示,尿素可被浮游植物利用,而且在一定條件下,還可能成為浮游植物的主要氮源和優(yōu)先利用氮源[2-6].尿素是河口和沿海水域浮游植物所利用的總氮的重要部分,占浮游植物利用總氮的50%以上[2-5,7-8].

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),尿素在浮游植物群落演替和有害藻類水華(HABs)發(fā)生中也起著重要作用.對(duì)浮游植物種群動(dòng)態(tài)的研究表明,尿素含量的上升將首先導(dǎo)致藍(lán)藻和渦鞭毛藻的產(chǎn)量增加[9-11].而當(dāng)環(huán)境中的尿素成為常見氮素形態(tài)時(shí),多種甲藻數(shù)量可能會(huì)激增[12].尿素很容易被浮游植物所吸收利用,且在HABs形成過程中發(fā)揮重要作用,近岸水體中尿素的濃度與有毒甲藻赤潮的發(fā)生密切相關(guān)[1,6].

浮游植物主要通過2種途徑將尿素代謝生成銨NH4+和二氧化碳CO2:一種是脲酶途徑,另一種是三磷酸腺苷脲酰胺酶途徑[13].目前已證實(shí)后一途徑只存在于Chlorophyceae的幾個(gè)種類中[14-15].現(xiàn)在,尿素等有機(jī)氮源與浮游植物群落演替以及赤潮形成的潛在聯(lián)系已成為國(guó)際上HABs研究中的熱點(diǎn)問題.然而,關(guān)于有害藻類對(duì)尿素等有機(jī)氮源的選擇性吸收、吸收利用速率、及其代謝途徑尚不明確.因此,建立藻類脲酶活性測(cè)定方法將有利于推進(jìn)相關(guān)研究,并進(jìn)一步揭示有機(jī)氮源在有害赤潮形成中的潛在作用.

目前,關(guān)于浮游植物脲酶活性的測(cè)定,國(guó)外主要采用Peers[13]的測(cè)試方法,而國(guó)內(nèi)尚無成熟的方法.有報(bào)道顯示,不同種類的微藻,其脲酶活性大小具有顯著差異[16].鑒于Peers[13]方法源于對(duì)2種硅藻脲酶活性的測(cè)定,而海洋微藻的脲酶活性顯然具有種間差異;而且,Peers[13]方法并未明確指出脲酶測(cè)定過程中的具體條件.為了建立一套成熟的藻類脲酶活性測(cè)定方法,本研究以典型赤潮藻東海原甲藻為實(shí)驗(yàn)材料,在Peers[13]方法的基礎(chǔ)上,探討了失活處理時(shí)間、提取液pH值、酶促反應(yīng)溫度以及微藻生長(zhǎng)階段對(duì)脲酶活性的影響,并對(duì)原有的脲酶活性測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藻種為典型赤潮藻東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense),采自我國(guó)東海赤潮高發(fā)海區(qū),經(jīng)毛細(xì)管分離培養(yǎng)成單細(xì)胞株系,保存于暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種庫(kù).

1.2培養(yǎng)條件

試驗(yàn)藻種于LRH-400-G室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度(23±1),℃光照強(qiáng)度約100μmol/(m2·s),光暗比12L12D.∶選用 f/2培養(yǎng)基[17],氮源為尿素.基礎(chǔ)介質(zhì)為人工海水(鹽度為30.5).接種密度約為2×108個(gè)/L.

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1失活處理時(shí)間對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響 取指數(shù)增長(zhǎng)期的藻液(密度:5×108個(gè)/L)24份,每份15mL,分別提取脲酶.

實(shí)驗(yàn)條件:對(duì)照組(t0)樣品100℃水浴失活5min;實(shí)驗(yàn)組(tf)樣品分別在100℃水浴中處理30,60,120,180,240,300s;t0和tf樣品均23℃水浴反應(yīng)30min;提取緩沖液(A)[13](50mmol/L磺酸, 150mmol/L磷酸鹽緩沖液,0.3%聚乙烯吡咯烷酮,0.1%Triton X-100,5mmol/L EDTA)和提取緩沖液(B)[13](50mmol/L磺酸,150mmol/L磷酸鹽緩沖液) pH值均為7.90.

1.3.2提取緩沖液pH值對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響 取指數(shù)增長(zhǎng)期的藻液(密度:5×108個(gè)/L)40份,每份15mL,分別提取脲酶.

實(shí)驗(yàn)條件:t0和tf樣品均100℃水浴失活5min;23℃水浴反應(yīng)30min;提取緩沖液(A)和(B)[13]的pH值均分別為7.40、7.50、7.60、7.70、7.80、7.90、8.00、8.10、8.20、8.30.

1.3.3水浴溫度對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響 取指數(shù)增長(zhǎng)期的藻液(密度:6.5×108個(gè)/L)40份,每份15mL,分別提取脲酶.

實(shí)驗(yàn)條件: t0和tf樣品均100℃水浴失活5min;樣品分別置于15,20,25,30,40,50,60,70,80, 90℃水浴下,緩沖液(A)和(B)[13]pH值均為7.90.

1.3.4不同生長(zhǎng)階段東海原甲藻脲酶活性的動(dòng)態(tài)變化 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的東海原甲藻接種于含有f/2培養(yǎng)基(氮源為尿素)的人工海水中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上),每48h取一定量的藻液(根據(jù)細(xì)胞密度),計(jì)數(shù)并提取脲酶.

實(shí)驗(yàn)條件: t0和tf樣品100℃水浴失活5min;樣品23℃水浴反應(yīng)30min;緩沖液(A)和(B)[13]pH值均為7.90.

1.4數(shù)據(jù)處理

Peers[13]方法以單個(gè)細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生氨的量來表示脲酶活性.

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1失活處理時(shí)間對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響

在試驗(yàn)所設(shè)的失活處理時(shí)間范圍內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),脲酶活性逐漸下降.在處理的前2min內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),脲酶活性快速降低;2min以后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),脲酶活性基本不再變化,活性接近于0(圖1).方差分析結(jié)果表明,脲酶失活處理時(shí)間＞2min時(shí),脲酶活性顯著低于脲酶失活處理時(shí)間＜ 2min時(shí)(P ＜0.001).

2.2提取液pH值對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響

圖1 100℃下處理時(shí)間對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響Fig.1 Effect of processing time on urease activity for Prorocentrum donghaiense

在試驗(yàn)所設(shè)的pH值范圍內(nèi),脲酶都有活性.當(dāng)脲酶粗提液pH值在7.5～7.9之間時(shí),隨著pH值的增大,脲酶活性呈上升趨勢(shì); pH值超過7.9以后,隨著pH值的增大,脲酶活性呈下降趨勢(shì);pH值為7.5時(shí),脲酶活性有最小值,分別為4.27fmol/(h·cell);在pH值為7.9時(shí),脲酶活性最大,為9.52fmol/(h·cell)(圖2).方差分析結(jié)果表明,提取液pH值為7.9時(shí),東海原甲藻脲酶活性顯著高于其他pH值處理(P ＜0.01).

2.3水浴溫度對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響

圖2 提取液pH值對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on urease activity for Prorocentrum donghaiense

在試驗(yàn)所設(shè)的溫度范圍內(nèi),脲酶都有活性.在15～70℃之間,隨著溫度的升高,脲酶活性呈上升趨勢(shì);當(dāng)溫度為70℃時(shí),脲酶有最大活性,為59.84fmol/(h·cell);在70～100℃之間,隨著溫度的升高,脲酶活性急劇下降;當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí),脲酶活性最小,為0.41fmol/(h·cell)(圖3).方差分析結(jié)果表明,當(dāng)溫度為70℃時(shí),東海原甲藻脲酶活性顯著高于其他溫度處理(P ＜0.001).

2.4不同生長(zhǎng)階段的東海原甲藻脲酶活性的大小

圖3 水浴溫度對(duì)東海原甲藻脲酶活性的影響Fig.3 Incubation temperature on urease activity for Prorocentrum donghaiense

隨著取樣時(shí)間的推遲,東海原甲藻細(xì)胞密度不斷增加.第1～9d,隨著時(shí)間的推遲,細(xì)胞密度迅速增大;第9～11d,細(xì)胞密度增長(zhǎng)速率不斷降低;第11 d以后,細(xì)胞密度基本不再變化(圖4).

圖4 東海原甲藻脲酶活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of urease activity of Prorocentrum donghaiense

在試驗(yàn)所設(shè)的取樣時(shí)間內(nèi),東海原甲藻脲酶均能檢測(cè)出活性.在接種第1d,脲酶活性較低,為8.31fmol/(h·cell);接種第3d,脲酶活性達(dá)到最大值,為11.09 fmol/(h·cell);第3～11d,脲酶活性呈下降趨勢(shì);第11d以后,脲酶活性基本不再變化,趨于穩(wěn)定.脲酶在接種第13d時(shí),有最小活性,為6.24fmol/(h·cell)(圖 4).方差分析結(jié)果表明,接種第 3d,東海原甲藻脲酶活性顯著高于其他時(shí)間(P ＜0.001).

不同生長(zhǎng)階段的東海原甲藻的脲酶活性不同.本試驗(yàn)中,東海原甲藻在接種后生長(zhǎng)迅速,第1～11d為其指數(shù)生長(zhǎng)期;第11d以后進(jìn)入穩(wěn)定期.脲酶活性在第3d出現(xiàn)最大,而第3d后酶活逐漸減低,第11d后穩(wěn)定.即指數(shù)生長(zhǎng)初期,脲酶活性最大;指數(shù)生長(zhǎng)中后期,脲酶活性逐漸降低;進(jìn)入穩(wěn)定期以后,脲酶活性沒有較大變化,趨于穩(wěn)定.

2.5海洋微藻脲酶活性測(cè)定方法的優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)Peers[13]原有海洋微藻脲酶活性測(cè)定方法進(jìn)行了優(yōu)化.首先,為避免引入NH4+而對(duì)實(shí)驗(yàn)造成污染,本研究未使用牛血清白蛋白(BSA).其次,為避免細(xì)胞研磨過程中粗酶提取液的損失,本研究利用超聲波破碎細(xì)胞,離心后得到上清液約600μL.第三,本研究顯示,100℃水浴60s脲酶并未完全失活,為穩(wěn)妥起見,改用100℃水浴5min.第四,采用靛酚藍(lán)比色法檢測(cè)銨[16],進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度.

3 討論

3.1微藻的脲酶活性受到環(huán)境條件和生長(zhǎng)階段的影響

Dyhrman等[18]研究發(fā)現(xiàn), 氮饑餓培養(yǎng)和尿素培養(yǎng)的Alexandrium fundyens和Alexandrium catenella具有較高的脲酶活性;而磷酸鹽饑餓培養(yǎng)株中未能檢測(cè)到酶活性;以氨作為唯一充足氮源時(shí)細(xì)胞的脲酶活性也很低.Solomon等[12]的研究也證實(shí),相比于NH4+,生長(zhǎng)在尿素和NO3–中的Prorocentrum minimum和Karlodinium veneficum的脲酶活性更高,并認(rèn)為微藻體內(nèi)脲酶活性受NH4+的抑制調(diào)節(jié),或者受尿素或NO3–的誘導(dǎo)作用.本研究中,東海原甲藻在剛剛加入大量尿素后(指數(shù)生長(zhǎng)期初期)有最大活性,可能是尿素的誘導(dǎo)作用的結(jié)果.

3.2試驗(yàn)條件的選擇是決定微藻脲酶活性測(cè)定的關(guān)鍵因素

脲酶測(cè)定過程中的100℃水浴失活時(shí)間、提取液pH值以及水浴反應(yīng)溫度,是影響脲酶活性的重要因素.試驗(yàn)中,如果脲酶100℃水浴處理時(shí)間過短(＜2min),則脲酶并不能完全失活,必定使得測(cè)定結(jié)果偏低;只有當(dāng)處理時(shí)間超過2min時(shí),脲酶才基本失活.Dyhrman等[18]在對(duì)有毒亞歷山大藻脲酶活性的測(cè)定中亦采用100℃處理2min.

另外,脲酶對(duì)于提取液pH值的變化很敏感,較小的pH值變化就可對(duì)脲酶活性產(chǎn)生較大的影響.當(dāng)提取液pH=7.9時(shí),酶促反應(yīng)速率最快,脲酶活性最高.Peers等[13]在對(duì)Thalassiosira weissflogii體外脲酶測(cè)定的研究中也發(fā)現(xiàn),pH為7.9時(shí)其脲酶活性最大.

Solomon等[6]和Fan等[10]都認(rèn)為,脲酶活性在一定溫度范圍內(nèi),與溫度呈正相關(guān).本研究結(jié)果也證明了這個(gè)推斷(圖3).Fan等[6]還進(jìn)行了3種藻的脲酶體外試驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)在3種藻類(Aureococcus anophagefferens,Prorocentrum minimu,和Thalassiosira weissflogii)中,脲酶活性都隨著測(cè)試溫度的升高而增強(qiáng),但最適溫度明顯不同.在體外試驗(yàn)中,Aureococcus anophagefferens的脲酶活性在0～30℃之間隨溫度的升高而增強(qiáng),在30～50℃之間保持穩(wěn)定;微小原甲藻(Prorocentrum minimum)的脲酶的體外活性在0～20℃之間隨溫度的上升而增強(qiáng),卻在20～50℃之間基本保持活性不變;而Thalassiosira weissflogii的脲酶活性從0～20℃之間隨溫度的升高而增強(qiáng),但超過20℃以后其活性隨溫度升高而減弱[6].本研究進(jìn)行的脲酶體外試驗(yàn)結(jié)果表明,東海原甲藻的脲酶活性在15～70℃之間,隨著溫度的升高而增強(qiáng).當(dāng)溫度達(dá)到80℃以后,脲酶活性急劇降低.脲酶在60～80℃之間某一溫度范圍時(shí)有最大活性,但由于試驗(yàn)中溫度取點(diǎn)間隔較大,具體溫度范圍無法得出.

本方法是將微藻體內(nèi)脲酶提取后,在體外進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn),測(cè)定脲酶活性,所以溫度條件應(yīng)盡量與微藻培養(yǎng)時(shí)的實(shí)際溫度保持一致.

4 結(jié)語

海洋微藻的脲酶活性除了取決于藻體本身特性,還受到溫度、pH值等環(huán)境條件的影響.海洋微藻脲酶活性的最佳測(cè)定條件為:100℃下失活處理時(shí)間＞2min;提取液pH值為7.9;酶促反應(yīng)溫度應(yīng)與微藻生長(zhǎng)溫度一致.

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Experimental study of urease activity in marine microalgae

. XU Ning*, SUN Shu-gang, DUAN Shun-shan, LI Ai-fen, ZHANG Cheng-wu (Key Laboratory of Water Eutrophication and Red-tide Control, Department of Education of Guangdong Province, Research Centre of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environmental Science, 2010,30(5)：689～693

X83

A

1000-6923(2010)05-0689-05

徐 寧(1971-),女,湖北孝感人,副研究員,博士,主要從事藻類生理生態(tài)學(xué)研究.發(fā)表論文40余篇.

2009-11-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40776078,40876074)

* 責(zé)任作者, 副研究員, txuning@163.com