于 芳,張安民,李 楠

大鼠間歇訓練對海馬 c-fos蛋白表達的影響

于 芳1,張安民2,李 楠3

(1.中北大學體育系,山西太原 030051;2.煙臺大學體育學院,山東煙臺 264005;3.山西醫(yī)科大學,山西太原 030001)

為了觀察大鼠間歇訓練對海馬 c-fos蛋白表達的影響。將雄性 SD大鼠 30只,隨機分為對照組(5只)、間歇訓練組(25只)。建立大鼠間歇游泳訓練模型,采用ABC免疫組織化學法,觀察大鼠海馬 c-fos陽性神經元細胞表達的變化(即 c-fos蛋白表達變化),并用圖像分析系統和統計學軟件進行圖像和數據分析。結果表明:訓練后大鼠海馬不同區(qū)域 c-fos陽性細胞表達密度明顯增高,與對照組相比均有顯著性差異 (P<0.01);CA2區(qū) c-fos陽性細胞表達迅速而明顯,訓練后 0.5 h即達峰值,而后回落;CA3區(qū) c-fos陽性細胞表達最為密集,訓練后 1 h達到高峰,而后快速回落; CA1區(qū) c-fos陽性細胞表達相對較少,1 h達到高峰,而后緩慢下降。結論:大鼠間歇訓練對海馬不同區(qū)域 c-fos蛋白表達有影響,具有時效性;海馬不同區(qū)域 c-fos蛋白表達在密度、時相上存在明顯差異,這可能與海馬不同區(qū)域對缺血、缺氧的耐受能力有關。

間歇訓練;海馬;c-fos蛋白

海馬是下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸 (HPA)應激反應的高位調節(jié)中樞。海馬在抑制下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸 (HPA)的應激反應中起著非常重要的作用。刺激海馬可抑制應激誘導的糖皮質激素的分泌,損傷整個海馬或海馬背側,則可引起HPA軸對多種應激源的敏感性增強,血漿糖皮質濃度異常升高[1]。據此,Fuchs提出邊緣系統—下丘腦—垂體—腎上腺軸 (HLPA)[2]的概念,因此,作為邊緣系統的海馬就更受關注。旨在通過觀察 6周間歇性負重游泳訓練后,大鼠海馬內 c-fos表達的分布特點、隨時間變化的規(guī)律,探討間歇訓練腦變化的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

采用雄性 SD大鼠 (山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供),3月齡,體重 220～250 g。飼養(yǎng)條件:分籠飼養(yǎng),每籠 5只,自由飲食,自然晝夜節(jié)律光照,室溫在20±5℃。相對濕度在40%～60%。將大鼠隨機分為:對照組 5只,間歇訓練組 25只。

1.2 訓練模型建立

采用游泳訓練方式建立訓練動物模型。游泳條件:塑鋼玻璃游泳池,150×60×70 cm,水深為大鼠身體長度的 2倍,約 60 cm,水溫保持在 33℃至36℃之間,每個游泳池隨機分配 5只大鼠。正式訓練前訓練組大鼠進行 3 d適應性游泳訓練,3 d的訓練時間分別為 15 min、20 min、30 min。隨后開始正式的游泳訓練,訓練安排見表 1。

表1 游泳訓練安排表

1.3 取材切片

6周間歇游泳訓練造模結束后,分即刻、0.5 h、1 h、2 h、4 h共 5個時刻取材。首先用 0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動物 (35～50 mg/公斤體重),打開胸腔,從心尖將穿刺針插入至升主動脈,然后迅速剪破右心耳,并快速灌入 400 ml預冷的生理鹽水沖洗血管,隨后用 4%多聚甲醛 250 ml快速灌注,接著放慢速度仍用 4%多聚甲醛 250 ml灌注,進行前固定,然后用 10%蔗糖 PBS液灌入 300 ml,至肝臟變硬變白為止。最后迅速斷頭,將頭部放在冰盤上,打開顱腔,暴露全腦,取出放在 4%多聚甲醛液內固定 2 h,再浸入 20%蔗糖 PBS液中 4℃過夜,待組織塊完全沉底后,用冰凍切片機連續(xù)冠狀切片,隔 4取 1,片厚 40μm。

1.4 免疫組織化學染色

切片經 0.5%Triton X-100 PBS液孵育 40 min,入H2O2中 10 min,然后加入 10%正常羊血清封閉40 min,再加入第一抗體 (兔抗鼠),37℃孵育 5 h后,4℃再孵育 36 h;隨后加入生物素化羊抗兔第二抗體,37℃孵育 40 min,接著入卵白素生物素復合物中,37℃孵育 40 min,以上各步驟均用 0.01 M PBS液經搖床充分漂洗 3遍 (每次 3～5 min),DAB呈色,用蒸餾水充分漂洗 3次 (每次 3～5 min), 0.2%明膠裱片,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

陰性對照組:分別以正常兔血清和 PBS代替第一抗體孵育,對照組無陽性產物即無特異性反應。

1.5 細胞記數和定量分析

其免疫陽性物質位于細胞核內,核深染,呈圓形或橢圓形,核仁透亮不著色,胞漿染色為陰性,無論染色深淺只要所示細胞為DAB特征染色 (光鏡下 c-fos免疫反應陽性神經元呈圓形和橢圓形),免疫陽性物質位于細胞核內,核深染,核仁透亮不著色,胞漿染色為陰性。在低倍鏡下和高倍鏡下與背景區(qū)分明確,即可認定為 FOS樣蛋白免疫反應(Fos-like immunreactivity FL I)陽性細胞核。40×10倍光鏡下計數每張切片雙側海馬的 FL I陽性神經元的數量,應用 SPSS13.0統計軟件進行分析,統計 FL I陽性細胞總數、均數、標準差和標準誤,每組內各時段間的差異用方差分析,組間比較用獨立 t檢驗。

2 實驗結果

光鏡下觀察,大鼠海馬區(qū) c-fos蛋白免疫反應物質呈棕黃色顆粒狀,染色均勻,主要位于神經細胞核內,胞漿內也有部分表達,背底呈淡黃或不著色。

圖象分析和統計學處理結果顯示 (見表 2,圖1):正常對照組和模型組大鼠下丘腦內均有表達,對照組 c-fos陽性細胞少量散在大鼠海馬;模型組 cfos陽性細胞數目明顯增多。間歇訓練結束后,在大鼠海馬 CA1區(qū)域 c-fos陽性細胞表達較平和,逐漸升高至 1 h達最高值,而后緩慢回落;CA2區(qū)域 cfos陽性細胞表達迅速增加,0.5 h即達峰值,1h時較峰值顯著下降 (P<0.05),然后維持在一定水平; CA3區(qū)域 c-fos陽性細胞表達密度持續(xù)升高,訓練后 1 h,c-fos陽性細胞數密度最大,達到峰值,較其他各組表達顯著升高 (P<0.05),2 h后表達快速下降。

表 2 大鼠海馬 CA1、CA2、CA3區(qū) c-fos陽性神經元圖像分析結果

圖 1 大鼠海馬 CA1、CA2、CA3區(qū) c-fos蛋白表達的時效性

3 討論

在原癌基因的家族中有一類能被第二信使所誘導的原癌基因稱為即刻早期基因 ( Immediately Early Genes,IEGs),亦稱快速反應基因。這類基因是指細胞經外部刺激后最先表達的一組基因,是聯系細胞生化改變與細胞最終對刺激發(fā)生特異性反應的中介物。因此,又被認為是第三信使[3]。c-fos屬于即刻早期基因 (IEG),近幾年來,隨著對生物學功能認識的逐漸深入,人們開始從不同的角度探討影響原癌基因 c-fos表達的因素。c-fos基因作為數十種原癌基因中的一種,在正常情況下參與細胞的生長、分化、信息傳遞、學習和記憶等生理過程,它通常處于不活動或表達很低的狀態(tài),在受到刺激時能做出迅速而短暫的反應 (刺激后數十分鐘內即開始表達,數十小時后就恢復正常水平),被認為是研究中樞神經系統最有代表性的即刻早期基因[4-5],且其表達產物 mRNA和核磷蛋白 (P55c-fos,簡稱 Fos)位于神經元的胞漿或胞核內,人們常將其視作神經元激活的一個重要指標。再之,不同性質和強度刺激時 c-fos表達的腦區(qū)、時程、密度和數量不同,用免疫組織化學方法顯示在各種刺激條件下 c-fos表達產物所在腦區(qū)和強度并結合其時程變化的特點,可對不同刺激在腦內的功能定位和神經通路進行研究[6]。短暫的刺激與長期的表達變化有著一定的聯系,這其中需要原癌基因表達的改變,同時也必然存在著一種或多種機制,將細胞表面刺激與神經元轉錄調節(jié)裝置偶聯起來,從而對細胞分化和可塑性起著重要作用[7]。近期不少學者注意到了這一點,開始研究應激對海馬 c-fos蛋白表達的影響。

已有研究證實,運動應激對海馬區(qū)的 c-fos基因表達有著顯著的影響,Dayas[8]和 Oladehin[9]分別發(fā)現跑臺運動和游泳均能增加海馬 c-fos基因表達,研究認為運動不僅能維持海馬神經元的活性,而且在運動影響神經系統的過程中起到了調控因子的作用。本研究建立了間歇訓練實驗動物模型,模擬負荷強度高、瞬間性強的無氧運動。選取海馬 CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū)為研究腦區(qū),觀察間歇訓練后,大鼠海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū) c-fos蛋白表達規(guī)律,探討不同形式訓練腦變化的可能機制。實驗結果顯示:間歇訓練后大鼠海馬不同區(qū)域 c-fos陽性細胞表達均顯著升高。其規(guī)律是:間歇訓練結束后,在大鼠海馬 CA1區(qū)域 c-fos陽性細胞表達較平和,逐漸升高至 1 h達最高值,而后緩慢回落;CA2區(qū)域 c-fos陽性細胞表達迅速增加,0.5 h即達峰值,1 h時較峰值顯著下降 (P<0.05),然后維持在一定水平;CA3區(qū)域 c-fos陽性細胞表達密度持續(xù)升高,訓練后 1 h,c-fos陽性細胞數密度最大,達到峰值,較其他各組表達顯著升高 (P<0.05),2 h后表達快速下降。這些結果提示:1)訓練應激能使海馬神經細胞內的即刻基因信息系統快速激活,使神經細胞處于活化狀,并對與海馬 c-fos蛋白調節(jié)有關的下游靶細胞及信號通路產生較長時間的影響;2)大鼠海馬 CA1區(qū)、CA2區(qū)和 CA3區(qū)中 c-fos表達在密度、時相上均存在明顯差異,這可能與海馬不同區(qū)域對缺血、缺氧的耐受能力有關;3)訓練應激引起海馬 c-fos表達上調的機制可能與NMDA受體的激活和胞內鈣離子濃度升高密切相關。Murphy[10]在腦缺血前應用NMDA受體拮抗劑MK-801,結果發(fā)現能明顯抑制 c-fos基因在腦缺血后的表達,證明NMDA受體參與了 c-fos基因的表達。也有研究認為[11],胞內鈣離子濃度升高時,與鈣調蛋白(CaM)結合形成 Ca/CaM復合物,對轉錄因子進行磷酸化修飾,從而啟動 c-fos基因的表達。

目前,對于運動訓練后 c-fos表達的作用尚有爭議,還有待進一步研究證實。我們的后期實驗將對c-fos的靶基因及效應進行研究,以揭示運動應激對機體影響的中樞機制。

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[責任編輯 江國平]

Study of the Influence of Interm ittent Exercise on the Expression of c-fos Protein in Hippocampus of Rat

YU Fang1,ZHANGAn-min2;L INan3
(1.College of Phydical Education,North Uuniversity of China,Shanxi 030051,China; 2.College of Phydical Education,YanTaiUniversity Yantai Shandong 264005,China; 3.MedicalUniversity of Shanxi,Taiyuan 030001,China)

This is to study the effect of inter mittent exercise on the expression of c-fos protein in hippocampus.Male SD rats were randomly divided into two groups:control group and intermittent exercise group.To establish the intermittent s wimming exercise models in rat,and detect the change of the expression of c-fospositive cells in hippocampus by usingABC immunohistochemistrymeans,then analyze the image and data by imaging analyzing system and statistic software.The result shows that: after exercise,the density of c-fos positive cellswere significantly higher in the different regions of hippocampus,with significant difference as comparedwith the control group(P<0.01);in CA2,the expression of c-fospositive cellswere increased obviously,gets up to the top at 05h,and then descend;In CA3,the express density of c-fos positive cells is the highest,the top at 1h,and then descend rapidly;in CA1,the express density of c-fos positive cells is small relatively,the top at 1h,and then descend slowly.Conclusion:inter mittent exercise could affect the expression of c-fos protein in hippocampus,and the expression of c-fos protein was timelines;the express density and phase of c-fos positive cells in the different regions of hippocampus have significant difference due to the tolerance of ischemia and anoxia.

inter mittent exercise;hippocampus;c-fos protein

G 804.2

A

1007-7413(2010)02-0078-04

2009-12-07

國家自然科學基金項目(30671019)

于芳(1968—),女,山西太原人,副教授。研究方向:運動醫(yī)學。