邸 青 張淑江 章時(shí)蕃 李 菲 孫日飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜緣枯病抗性基因的SRAP標(biāo)記篩選

邸 青 張淑江 章時(shí)蕃 李 菲 孫日飛*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以大白菜緣枯病抗病材料山西信中籽-339和感病材料山西信中籽-332為親本構(gòu)建包含 111個(gè)單株的F2分離群體，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合分離群體混合分析法（BSA）篩選與抗病基因連鎖的標(biāo)記。結(jié)果表明：在 672對 SRAP引物中有 19對引物在抗感病池間存在多態(tài)性，經(jīng)過單株篩選，BMe10CO11標(biāo)記與大白菜緣枯病抗病基因連鎖，其遺傳距離為11.4 cM。

大白菜；緣枯??；SRAP標(biāo)記

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕起源于中國，是十字花科蕓薹屬中重要的蔬菜作物之一。近年來在大白菜種植過程中出現(xiàn)了一種新型病害，該病害多發(fā)生于北方秋季，始發(fā)于早秋，隨著時(shí)間的推移，病情逐漸加重，直至植株死亡。染病初期多數(shù)葉片葉緣焦枯，隨著病情發(fā)展，由葉緣隨葉脈向基部擴(kuò)展，葉脈、葉柄失綠、枯黃，最終全株干枯死亡。迄今，其病原物尚未分離出，也未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道這一病害，根據(jù)該病害發(fā)病癥狀，暫定名為緣枯病。該病一旦發(fā)生，將導(dǎo)致大白菜減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。選育抗緣枯病的品種是保持大白菜生產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施，利用分子標(biāo)記輔助選擇抗病品種是經(jīng)濟(jì)有效的育種途徑之一。

目前，分子標(biāo)記輔助選擇已廣泛應(yīng)用于園藝作物育種方面（張劍俠 等，2001；姬廣海 等，2004；孟芳 等，2007）。在大白菜病害方面常用的分子標(biāo)記主要有 AFLP、RAPD、SSR等（王美 等，2003；韓和平 等，2004；冷月強(qiáng) 等，2007）。SRAP標(biāo)記即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-relate amplified polymorphism）是一種基于PCR的新型標(biāo)記系統(tǒng)，試驗(yàn)操作過程簡單，擴(kuò)增條帶清晰，結(jié)果穩(wěn)定，是一種兼有AFLP、RAPD和SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又克服了它們一些缺點(diǎn)的分子標(biāo)記（任羽 等，2004）。

由于SRAP標(biāo)記多態(tài)性高、重復(fù)性好、在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、比較基因組學(xué)、圖譜構(gòu)建等方面（Riaz et al.，2001；Ferriol et al.，2003；林忠旭 等，2003）。Li和Quiros（2001）用SRAP標(biāo)記研究了大白菜、油菜、芹菜，獲得了雄性不育基因、1個(gè)CMS育性恢復(fù)基因和1個(gè)抗病毒基因的SRAP標(biāo)記。目前SRAP技術(shù)尚未應(yīng)用到大白菜抗病性的標(biāo)記中。

本試驗(yàn)在田間自然鑒定的基礎(chǔ)上，通過SRAP標(biāo)記技術(shù)篩選與大白菜緣枯病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，既可用于大白菜緣枯病抗性的輔助選擇，同時(shí)也為緣枯病抗性基因的精細(xì)定位及克隆奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供。根據(jù)本課題組3 a田間鑒定所確定，以高抗緣枯病材料早熟深綠色束心類型山西信中籽-339（簡稱 339，下同）、山西信中籽-331、山西信中籽-338，高感緣枯病材料早熟深綠色束心類型山西信中籽-332、山西信中籽-340分別為親本，配制雜交組合339×332、331×332、338×340。3個(gè)雜交組合后代自交構(gòu)建F2分離群體，進(jìn)行抗病性遺傳學(xué)分析。

利用339×332組合構(gòu)成的F2群體，包含111個(gè)單株，其抗性出現(xiàn)3∶1分離，此群體用于連鎖分析。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鑒定 于 2009年秋季田間露地定植親本、F1及 F2分離群體，使其自然發(fā)病，在發(fā)病過程中共進(jìn)行4次調(diào)查（9月18、28日，10月8、18日），調(diào)查間隔時(shí)間相同。根據(jù)大白菜葉片干枯程度判定單株對緣枯病的抗性。當(dāng)大白菜由內(nèi)向外整株干枯時(shí)，表現(xiàn)高感；只外葉葉緣少量干枯，外葉有少量褐色斑點(diǎn)，為中抗；整株沒有干枯葉，為高抗（圖 1）。用χ2測驗(yàn)法檢驗(yàn)所得F2抗感分離比例的適合度。

1.2.2 基因組DNA提取及建池 大白菜田間定植7 d后、發(fā)病前采集單株葉片，凍干磨成粉末，利用改良CTAB法提取親本、F1、F2單株基因組DNA（Wang et al.，2005），利用Nanodrop ND1000檢測DNA濃度及純度，并將DNA濃度稀釋為40 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)田間鑒定結(jié)果，分別選取高抗單株10株構(gòu)成抗病池，高感單株10株構(gòu)成感病池。

圖1 大白菜緣枯病病情分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 SRAP反應(yīng)體系 所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用于分析的SRAP引物來源于十字花科作物、水牛草、黃瓜、棉花等，合成正向引物25條、反向引物32條（Li & Quiros，2001；Riaz et al.，2001；Lin et al.，2003；Budak et al.，2004；Wang et al.，2005）。用抗、感病池對SRAP引物進(jìn)行篩選，挑選能夠產(chǎn)生特異性條帶的引物，再對F2分離群體單株進(jìn)行擴(kuò)增。

SRAP-PCR反應(yīng)體系：在20 μL反應(yīng)體系中，16 ng·μL-1DNA 8 μL，10×Buffer 2 μL，0.2 mmol·L-1dNTP 1.6 μL，0.75 ng·μL-1引物 1.5 μL，0.05 U·μL-1Taq 酶 0.2 μL，其余用蒸餾水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，接著94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；然后將退火溫度變?yōu)?0 ℃，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在8 %聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后進(jìn)行銀染顯色。

1.2.4 連鎖分析 根據(jù)親本與F1的帶型，統(tǒng)計(jì)F2單株帶型，用Joinmap 4.0軟件進(jìn)行目的基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間鑒定遺傳分析

田間調(diào)查結(jié)果表明（表1），339×332 F1群體發(fā)病率23 %，死亡率0；F2群體發(fā)病率57 %，死亡率26 %，抗感比值2.82，P值為0.56，χ2值為0.34，在0.05水平下（χ20.05=3.841）實(shí)際值與理論值差異不顯著。331×332 F1群體發(fā)病率15 %，死亡率0；F2群體發(fā)病率60 %，死亡率23 %，抗感比值為3.28，P值為0.22，χ2值為0.63，在0.05水平下實(shí)際值與理論值差異不顯著。338×340 F1群體發(fā)病率0，死亡率0；F2群體發(fā)病率50 %，死亡率19 %，抗感比值4.27，P值為0.13，χ2值為2.25，在0.05水平下實(shí)際值與理論值差異不顯著。

3個(gè)組合的F1發(fā)病率均較低，死亡率全部為0，即F1全部表現(xiàn)為抗病，F(xiàn)2群體出現(xiàn)抗感分離，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，在0.05水平下3個(gè)群體的抗感分離比值與理論值差異不顯著，3個(gè)F2群體的抗性全部表現(xiàn)為近似3∶1的分離比，符合顯性單基因控制模型?？梢缘贸觯鸿b定的3個(gè)大白菜這3個(gè)群體對緣枯病的抗性是由1個(gè)顯性基因控制。

表1 田間調(diào)查抗感遺傳規(guī)律

2.2 與緣枯病抗病基因連鎖的SRAP標(biāo)記

利用抗、感病池對672對SRAP隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，平均每對引物產(chǎn)生條帶8.9條。篩選到與緣枯病抗性基因連鎖的標(biāo)記 1個(gè)，命名為BMe10CO11，標(biāo)記片段長度約160 bp（圖2）。在 F2分離群體 111個(gè)單株中驗(yàn)證 BMe10CO11的多態(tài)性（圖3）。

2.3 遺傳連鎖分析

根據(jù)田間鑒定結(jié)果，篩選出的 82個(gè)抗病單株中，74個(gè)有標(biāo)記條帶，8個(gè)沒有標(biāo)記條帶；29個(gè)感病單株中，18個(gè)沒有標(biāo)記條帶，11個(gè)有標(biāo)記條帶。在這 111個(gè)單株中，共有19個(gè)發(fā)生了重組（表2）。用Joinmap 4.0軟件分析，BMe10CO11與抗緣枯病基因間的遺傳距離是11.4 cM（圖4）。

圖2 引物B10CO11對親本和F1的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 引物BMe10CO11對親本和F2部分單株的擴(kuò)增結(jié)果

表2 F2分離世代目標(biāo)條帶分離結(jié)果

圖4 遺傳連鎖圖

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對親本、F1、F2群體在發(fā)病期進(jìn)行田間鑒定，根據(jù)植株干枯程度判定單株抗性，并通過χ2檢驗(yàn)適合度，發(fā)現(xiàn)F2群體對緣枯病的抗性是由1個(gè)顯性基因控制。并采用SRAP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合BSA法對緣枯病抗性基因進(jìn)行標(biāo)記，在 672對 SRAP引物中獲得 1個(gè)與目標(biāo)基因間距為11.4 cM的SRAP標(biāo)記BMe10CO11。

SRAP標(biāo)記是針對基因外顯子里GC含量豐富，而啟動子、內(nèi)含子里AT含量豐富的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性（Li & Quiros，2001）。SRAP標(biāo)記以其簡單、穩(wěn)定、共顯性、在基因組中分布均勻的優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多個(gè)物種中。本試驗(yàn)應(yīng)用SRAP標(biāo)記技術(shù)，篩選到1個(gè)與抗緣枯病基因連鎖的標(biāo)記。理論上可以用抗病材料與遺傳背景良好但不抗緣枯病的優(yōu)良自交不親和系作為親本進(jìn)行雜交，得到的F1在苗期用該標(biāo)記選擇抗緣枯病基因的單株，再用該優(yōu)良自交不親和系作為輪回親本連續(xù)回交，經(jīng)6～7代選擇，就可育成含有抗緣枯病基因的新優(yōu)良自交不親和系材料，加快了育種進(jìn)程。

此外，為了進(jìn)一步提高試驗(yàn)的重復(fù)性及穩(wěn)定性，可以回收SRAP標(biāo)記的特異性條帶，進(jìn)行挖帶、克隆、測序，并根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)更長的寡核苷酸引物對，將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

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Screening of SRAP Marker Linked to Marginal Leaf Scorch Resistance Gene in Chinese Cabbage

DI Qing, ZHANG Shu-jiang, ZHANG Shi-fan, LI Fei, SUN Ri-fei*
（Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

The segregating population was developed from a cross between a resistance Chinese cabbage（Brassica rapaL. ssp.pekinensis）339 and the susceptible 332. The molecular marker techniques SRAP and bulked segregation analysis（BSA）were used to screen markers linked to the disease resistance genes. Among the 672 primer combinations, BMe10CO11 showed polymorphism between bulks of resistance and susceptible. The distance of BMe10CO11 was 11.4 cM.

Chinese cabbage; Marginal scorch; SRAP marker

S436.341.1+9

A

1000-6346（2010）16-0021-05

2010-04-14；接受日期：2010-06-18

農(nóng)業(yè)部園藝作物遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目，國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BADBB06-4-6，2008BADB1B01-1），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（nyhyzx07-007）

邸青，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：ayoula114@yahoo.com.cn

* 通訊作者（Corresponding author）：孫日飛，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：rifei.sun@caas.net.cn