周 鳳，張東旭，呂洪飛

(1.山西大同大學農(nóng)學與生命科學學院，山西大同 037009; 2.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004）

4種金絲桃屬植物基因組DNA提取及RAPD分析

周 鳳1，張東旭1，呂洪飛2

(1.山西大同大學農(nóng)學與生命科學學院，山西大同 037009; 2.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004）

目的探究金絲桃屬基因組DNA的提取方法及用RAPD分析的技術(shù)體系.方法采用改良的低pH值高鹽法獲得高質(zhì)量的金絲桃屬植物總DNA，從80個10-mer隨機引物中篩選出12個，對4種金絲桃屬植物的基因組DNA進行RAPD分析.結(jié)果共產(chǎn)生了330條DNA片段，其中218條譜帶具有遺傳多態(tài)性，約占66.1%.結(jié)論RAPD分析揭示4種金絲桃屬植物之間的DNA指紋存在明顯的種間差異，能為金絲桃屬植物的分類鑒定提供遺傳學依據(jù).

金絲桃屬 DNA提取 RAPD分析

金絲桃屬(Hypericum L.)隸屬藤黃科，全世界約400余種，我國約有8組55種8亞種，該屬植物產(chǎn)于全國各地，但主要集中于西南地區(qū)[1].金絲桃屬植物中含多種藥用成分，如金絲桃素類、槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁、黃烷酮醇類、黃酮類、咄酮類、香豆素類和間苯三酚衍生物(貫葉金絲桃素)等[2].近年來的研究表明，金絲桃屬植物所含金絲桃素類化合物具有抗抑郁、抑制中樞神經(jīng)、抗病毒和增強免疫功能，并具有顯著的抗DNA、RNA病毒作用，可用于艾滋病的治療，從而引起醫(yī)藥界的重視[3].本課題組曾發(fā)現(xiàn)金絲桃屬植物的葉表皮微形態(tài)[4]、葉內(nèi)部的分泌結(jié)構(gòu)類型、分布密度、大小和位置[3]以及紅外光譜圖[5]等存在較大差異，可用作金絲桃植物的鑒別指標，然而用分子生物學手段鑒別金絲桃屬植物至今未見報道.

隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是20世紀90年代發(fā)展起來的DNA分子遺傳標記技術(shù)，已被廣泛地應(yīng)用在藥用植物分類鑒別中[6-8].本研究試圖以金絲桃屬的4種植物為材料種，發(fā)展適于金絲桃屬植物的總DNA提取方法及RAPD分析技術(shù)體系，以期為我國金絲桃屬植物種類鑒定和優(yōu)良栽培種選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于DNA提取的葉片采自浙江師范大學學校綠化科苗圃栽培的金絲桃屬植物，分別是貫葉連翹(H.perforatum L)、小連翹 (H.erectum Thunb ex Murray)、元寶草 (H.sampsonii Hance)、漿果金絲桃(H. androsaemum Linn).

1.2 總DNA的提取

采用改良的低pH值高鹽法，步驟如下:①取新鮮植物葉片約0.4 g，用70%酒精洗6 s，用蒸餾水清洗三次;②把洗凈的葉片于研缽中快速用液氮研成粉末，將粉末轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中;③加入1 mL預冷的提取介質(zhì) (100m mol／L pH 4.8 NaAc，50 m mol／L pH 8.0 EDTANa2，500 m mol／L NaCl，2% PVP，1.4%SDS，其pH為5.5);④置浮橋上65℃水浴保溫40 min，其間顛倒混勻幾次;⑤室溫下12 000 r／min離心15 min，棄沉淀.⑥加入2/3體積的pH 4.8 2.5 mol／L Kac，混勻，0℃放置30min沉淀蛋白質(zhì)，4℃12 000 r／min離心10～20 min，棄沉淀;⑦上清液加入0.6倍體積的-20℃預冷的異丙醇.溫和混勻后于4℃沉淀核酸2 h;⑧4℃12 000 r／min離心20 min，收集沉淀;⑨用750μL無菌蒸餾水溶解沉淀，并于50℃水浴助溶;⑩4℃12 000 r／min離心10 min，棄不溶物.上清液中加入0.6倍體積異丙醇，1/10體積3mol/L NaAc(pH 5.2)，混勻后于12 000 r／min離心10 min收集DNA;（11）500 μL 70%乙醇洗滌沉淀.空氣干燥5 min;（12）溶于50 μL 0.1×TE緩沖液中;（13）加3μLRNaseA混勻，并在37℃下保溫30min，分裝后存于4℃或-20℃?zhèn)溆?

1.3 總DNA的純度檢測

總DNA純度和質(zhì)量的檢驗采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢驗和紫外吸收檢驗 (紫外分光光度計: Ultrospec 4000，UV/Visible Spectrophotometer)，測定提取總DNA樣品A260、A280值.以A260/A280值估測其純度，以公式:雙鏈DNA濃度 (μg/μl)＝A260/ 0.020計算其濃度.

1.4 引物及其篩選

本試驗所用的隨機引物購自北京經(jīng)科生物工程有限公司，包括第V組、第W組、第Y組和第Z組共80條引物，分別記為OPV-01至OPV-20，OPW-01至OPW-20，OPY-01至OPY-20，OPZ-01至OPZ-20.任取一個模板，對所有引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增條帶數(shù)的多少對引物做初步篩選，篩選原則是擴增條帶數(shù)多且條帶清晰的引物.

1.5 RAPD擴增反應(yīng)

PCR反應(yīng)在 GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer Corporation)上進行，經(jīng)預實驗優(yōu)化條件后確定反應(yīng)體系總體積為25μL:10×PCR buffer (500 m m ol／L KCl，100 m m ol／L Tris-HCl， 1.0% TritonX-100)2.5μL，引物 (8 p mol／L)2μL，dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各1 mmol/L)2.5μL，模板DNA 1.7μL(約含DNA 100 ng/μL)，MgCl2(25 mmol/L)2μL，Taq酶0.3μL(0.5 U/μL)，無菌水14 μL，反應(yīng)混合物用16μL石蠟油覆蓋.

擴增反應(yīng)的程序為:94℃預變性5min，進入40個PCR循環(huán) (94℃變性60 s，36℃復性60 s，72℃延伸90 s)，最后于72℃延伸5 min.取擴增產(chǎn)物8μL，加2μL上樣緩沖液，用含有0.5μg/ m L溴化乙錠(EB)的1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以0.5×TBE為電極緩沖液，電壓為5 V/cm，穩(wěn)壓電泳1.5 h.電泳結(jié)果在Pharmacia Biotech ImageMaster VDS系統(tǒng)下觀察、照相記錄結(jié)果.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

（2）民營企業(yè)融資難問題。民營企業(yè)在實際運行中，缺少強大的資金支持，以致于面臨著生存危機。具體表現(xiàn)為：①銀行貸款存在一定的限制。民營企業(yè)由于規(guī)模相對較小，可用于抵押的資產(chǎn)較少；同時缺少健全的財務(wù)制度，增加了破產(chǎn)風險，因此從銀行貸款較難。②政策有失公平，民營企業(yè)缺少直接融資途徑。當前國有企業(yè)占據(jù)市場主體，民營企業(yè)的融資渠道相對較少，融資成功幾率較小。

根據(jù)擴增結(jié)果，計算多態(tài)位點百分率，按瓊脂糖凝膠同一位置上DNA帶的有無進行統(tǒng)計，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無帶的記為“0”.根據(jù)公式S＝Nxy/(Nx+Ny)計算不同樣本之間的相似系數(shù)，其中S表示相似系數(shù)，Nxy為樣本x和樣本y共同具有的分子量相同的DNA擴增譜帶數(shù)，Nx為樣本x的DNA擴增譜帶數(shù)，Ny為樣本y的DNA擴增譜帶數(shù).各樣本間的遺傳距離P＝1-S.根據(jù)遺傳距離并利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟中的Hierarchical Cluster Analysis方法(Clustermethod:Between-groups linkage; Measure:Interval(Euclidean distance))構(gòu)建聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA提取

紫外分光光度計測定的結(jié)果表明，提取的4個DNA樣本的A260/A280值在1.85～2.0之間，均適合做RAPD分析，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對4個DNA樣本進行檢測，只有個別樣本有少許降解 (圖1)，說明本研究所有DNA提取方法對金絲桃屬植物是有效的.

圖1 總DNA電泳圖

2.2 隨機引物的篩選和擴增結(jié)果

通過比較RAPD擴增效果，用貫葉連翹DNA樣品對四組80個引物進行初步篩選，有48個引物可以得到較清晰擴增產(chǎn)物，然后用這48個引物對四種植物的DNA樣品對48個引物復篩，得到12個多態(tài)性較高的引物.以這12條引物對4種植物DNA樣品進行RAPD擴增，共獲得330條擴增產(chǎn)物，每個引物的擴增條帶為13～42條，平均為29.2條，其中218條具有遺傳多樣性，約占總數(shù)的66.1%，每個引物檢測到的RAPD多態(tài)譜帶不等，從10條到26條，平均為18.2條(圖2、表1).這表明金絲桃屬物種間個體間的DNA多態(tài)性是比較豐富的，因此，利用RAPD標記在DNA水平上檢測金絲桃屬種間差異是可行的.

2.3 金絲桃屬種間聚類分析

根據(jù)12個引物得到的RAPD標記，在SPSS 13.0程序中計算任意兩個物種間的Nei-Li遺傳相似性系數(shù)(表2)，根據(jù)遺傳相似性系數(shù)進行UPCMA聚類分析，構(gòu)建遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2).

圖2 引物OPW-01擴增產(chǎn)生的RAPD帶型

表1 金絲桃屬植物RAPD分析所用引物及其擴增結(jié)果

表2 金絲桃屬不同物種之間的遺傳相似系數(shù)

圖3 金絲桃屬4個不同樣本RAPD分析聚類圖

3 討論

3.1 總DNA的提取

獲得高質(zhì)量的DNA樣品是進行分子生物學研究的前提，DNA樣品質(zhì)量的好壞往往是分子生物學下一步實驗成敗的關(guān)鍵.目前植物基因組DNA的提取方法有CTAB法、SDS法及蛋白酶K法等.不同的植物材料，適合的提取方法也不同.造成這種現(xiàn)象的原因在于，不同的植物具有不同的細胞壁結(jié)構(gòu)，細胞的內(nèi)含物如酚類、多糖、帖類等次生代謝物質(zhì)的含量差別很大.這些內(nèi)含物可以與DNA結(jié)合形成復合物，DNA被埋在這種粘稠的膠狀物中難以溶解，甚至產(chǎn)生不同程度的褐變.因此，對于不同的物種可能都需要尋找一套相應(yīng)的最優(yōu)提取方案，以獲得高質(zhì)量的DNA樣品.

金絲桃屬植物由于其組織細胞中含有大量的多酚、多糖及其它次生代謝產(chǎn)物[9]，如果提取方法選擇不當，會使DNA埋在這種粘稠膠狀物中而難以溶解[10]，從而干擾后續(xù)的操作.許多研究者發(fā)現(xiàn)，RAPD技術(shù)并非理論上所想象的那樣“簡便易行”.一些植物體內(nèi)的特殊內(nèi)含物和次生產(chǎn)物 (如單寧、脂質(zhì)、多酚及色素類物質(zhì))直接影響Taq酶的活性，導致擴增失敗.因此，針對富含多酚、多糖等物質(zhì)的金絲桃屬植物找出適宜的高純度、大分子量DNA的高效提純方法就顯得十分必要.本研究分別用CTAB法、SDS法、普通高鹽法和低pH值高鹽法對金絲桃屬四種植物葉片的總DNA進行了提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTAB法和SDS法不適于該屬四種植物的總DNA的提取，基本上沒有得到DNA，普通高鹽法提取的總DNA純度不夠好，但低pH值高鹽法很適合該屬四種植物總DNA的提取，用該方法得到的DNA純度較理想，OD260/280值都在1.85～2.0之間.用于RAPD擴增得到的結(jié)果也比較好.該方法提取DNA的得率高、試劑易得、步驟簡單，不失為提取金絲桃屬植物DNA的一種好方法.金絲桃屬植物含多酚物質(zhì)較多，高鹽低pH值法采用pH 5.5的酸性提取液避免多酚類物質(zhì)電離化及進一步氧化，同時利用PVP結(jié)合酚類物質(zhì);高濃度K+利于SDS與蛋白質(zhì)及多糖形成復合物，復合物經(jīng)離心或過濾除去.與CTAB法、SDS法相比，步驟少，材料損失少，另一方面，通過延長65℃水浴保溫和第一次用異丙醇沉淀DNA的時間，可取得較高得率，按每克鮮重葉片計，所獲得的DNA在1 500μg以上.高鹽低pH法的優(yōu)越性還在于，不采用酚、氯仿等有毒試劑，不需CTAB、SDS、酶等價格較高的試劑，技術(shù)環(huán)節(jié)容易掌握.

3.2 RAPD分析

RAPD技術(shù)原理簡單，操作簡便，是目前眾多分子標記技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù);但隨著PCR條件的變化，會出現(xiàn)不同的擴增結(jié)果，且一些試驗也發(fā)現(xiàn)RAPD反應(yīng)的不穩(wěn)定性[11].影響擴增的主要因子有DNA的模板含量和大小、Tsq酶含量、Mg2+濃度、dNTP濃度、熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)計及引物濃度等.

利用12個引物對4種金絲桃屬植物的模板進行RAPD分析，研究了它們種間的遺傳分化.共獲得218條擴增穩(wěn)定、重復性好的擴增帶，反映出金絲桃屬種間存在著豐富的遺傳差異.從表2中我們得到金絲桃屬四種植物的遺傳相似性系數(shù)在0.095～0.190之間，可見這些種之間的遺傳距離都比較遠.相對而言，貫葉連翹與小連翹親緣關(guān)系較近，元寶草與漿果金絲桃親緣關(guān)系較近(圖3).說明用RAPD技術(shù)鑒別金絲桃屬植物的親緣關(guān)系是可行的，這為進一步探究金絲桃屬植物種屬分類、物種起源等奠定了技術(shù)和理論依據(jù).

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Genom ic DNA E xtraction and RAPD A nalysis of the F our S pecies in Hypericum Linn.

ZHOU Feng1，ZHANG Dong-xu1，LǖHong-fei2
(1.School of Agriculture and Life Sciences，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009; 2.School of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang，321004)

Objective To investigate genomic DNA extraction methods and the technical system of RAPD analysis in Hypericum Linn.Methods A low-pH and high-saltmethod to obtain high-quality total DNA of Hypericum Linn.，12 primerswere screened from 80 10-mer random primers，and were used to analysis genomic DNA of four species of Hypericum Linn.Results Generated 330 DNA fragments，218 bands ofwhich were polymorphic，accounting for about66.1%.Conclusion DNA fingerprints of four species had significant differences by RAPD analysis，these could provide genetic basis for taxonomic identifications of Hypericum Linn.

Hypericum Linn;DNA extraction;RAPD analysis

Q943

A

〔編輯 楊德兵〕

1674－0874（2010）04－0064－04

2010-04-06

周鳳(1964-)，女，山西侯馬人，碩士，副教授，研究方向:農(nóng)業(yè)基礎(chǔ).