賀 曾，杜立波，姜玉崗，陳良兵，王廣清,田 秋，劉 科，杜林方，劉 揚(yáng)

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064

2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

內(nèi)源性超氧陰離子自由基介導(dǎo)的萊茵衣藻光系統(tǒng)Ⅱ蛋白組分損傷

賀 曾1，杜立波2，姜玉崗2，陳良兵2，王廣清2,田 秋2，劉 科1，杜林方1，劉 揚(yáng)2

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064

2.中國科學(xué)院化學(xué)研究所，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190

選取野生型萊茵衣藻CC-125和過氧化氫酶缺失突變體CC-2913為研究對象，采用spin trapping-ESR方法通過光照萊茵衣藻類囊體膜捕獲到了O2·－，并且在同樣條件下也檢測到了來源于O2·－歧化產(chǎn)生的H2O2。另據(jù)類囊體膜電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果：萊茵衣藻在生長過程中添加內(nèi)源SOD 抑制劑TCNE后，CC-2913類囊體膜光系統(tǒng)蛋白組分的損傷要比野生型CC-125更為嚴(yán)重。通過對上述O2·－與H2O2信號的對比分析可知，雖然O2·－不是造成類囊體膜光系統(tǒng)Ⅱ蛋白組分損傷的直接因素，但它可借助歧化產(chǎn)物H2O2造成光系統(tǒng)蛋白組分的損傷。

萊茵衣藻；蛋白質(zhì)損傷；超氧陰離子；過氧化氫；類囊體膜

0 引 言

早在上世紀(jì)50年代，Mehler曾提出高等植物類囊體膜經(jīng)光照可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2·－)[1]。O2·－在高等植物光合作用的活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 代謝中具有重要意義，高等植物細(xì)胞內(nèi)的其它ROS往往都是由O2·－歧化或后續(xù)衍生而來，如過氧化氫(H2O2)與羥基自由基 (·OH)等[2]。 由于O2·－性質(zhì)活潑，又極易轉(zhuǎn)化成其它的ROS，使得對其所導(dǎo)致的直接生物學(xué)作用仍不甚明了。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中曾系列報道了高等植物菠菜PSⅡ中O2·－產(chǎn)生的位點(diǎn)、分子機(jī)制以及由O2·－或次生H2O2與·OH導(dǎo)致的PSⅡ放氧復(fù)合物 (oxygen-evolving complex，OEC)的損傷[3～6]。

另一方面，考慮到萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)是研究光合作用的模式生物之一，它的光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與高等植物非常相近[7,8]，且具有結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速、生長條件嚴(yán)格可控、易于活體 (in vivo)實(shí)驗(yàn)研究且基因組測序已完成等特點(diǎn)[9]。作者等[10]在近期工作中也曾進(jìn)行有關(guān)萊茵衣藻光系統(tǒng)內(nèi)的超氧陰離子自由基的ESR研究，發(fā)現(xiàn)其O2·－表現(xiàn)行為與高等植物菠菜的光系統(tǒng)極其相近。

無論作者前期關(guān)于菠菜O2·－、H2O2與·OH損傷OEC的新分子機(jī)制探索[6]，還是近年來其它有關(guān)強(qiáng)光下ROS損傷OEC、D1蛋白或PSII其它蛋白組分的實(shí)驗(yàn)研究[11～13]，發(fā)現(xiàn)缺乏一個普遍適合于活體細(xì)胞層面分析ROS對光系統(tǒng)蛋白損傷作用的生物體系。然而，結(jié)合近期工作體會，作者發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶缺失的萊茵衣藻突變體CC-2913是解決這一問題的絕佳材料。為此，本文通過對野生型萊茵衣藻CC-125和過氧化氫酶缺失突變體CC-2913類囊體膜在光照條件下O2·－與H2O2的產(chǎn)生規(guī)律，以及相關(guān)蛋白組分損傷的對比分析，初步探索了由內(nèi)源性超氧陰離子自由基介導(dǎo)的光合蛋白組分損傷的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 萊茵衣藻的培養(yǎng)

野生型萊茵衣藻CC-125(mating type＋)及突變體CC-2913(mating type＋)均購自美國杜克大學(xué)衣藻研究中心，參照Harris[14]的方法，22℃恒溫培養(yǎng)于滅菌的TAP培養(yǎng)液，在20 μmol·m－2·s－1白色光源下、每天按 12 小時光暗周期交替培養(yǎng)。

1.2 萊茵衣藻類囊體膜的制備

類囊體膜的制備參考Selman-Reimer[15]的方法：提取緩沖液為0.33 mol/L D-山梨醇、10 mmol/L Na4P2O7、3 mmol/L MgCl2(pH 6.5)。超聲波破碎細(xì)胞功率為120 W，每次破碎持續(xù)20 s，間隔60 s，共4次。沉淀懸浮于含0.4 mol/L蔗糖、50 mmol/L Mes-NaOH(pH 6.5)、10 mmol/L NaCl的混合液 (SMN溶液)并儲存于液氮中。所有步驟均在4℃下避光進(jìn)行。葉綠素的定量采用Arnon的方法[16]。

1.3 在光照條件下類囊體膜中H2O2的定量檢測

過氧化氫電極法測H2O2標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線：首先將ISO-HPO-2型過氧化氫電極 (World Precision Instruments,Inc.USA)用pH值6.5的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗，并達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。配制5 mmol/L H2O2母液，依次向4 ml上述磷酸鹽緩沖液中加入H2O2母液8、16、24、32、40 μl，檢測不同濃度H2O2的響應(yīng)電流增加值ΔI(pA)，擬合c(H2O2)-ΔI，得線性標(biāo)準(zhǔn)曲線：ΔI(pA)=15.47c(H2O2)(μmol/L)。

用過氧化氫電極檢測懸浮于SMN溶液 (pH 6.0)中的類囊體膜 (Chl=0.5 mg/mL)在330 μmol·m－2·s－1光照條件下電流的變化值，再通過與 H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，求出光照條件下實(shí)時產(chǎn)生的H2O2量。

1.4 超氧陰離子自由基的ESR測定

在22℃恒溫避光條件下，將類囊體膜 (葉綠素濃度調(diào)整為0.6 mg/mL)懸浮于含40 mmol/L BMPO的SMN溶液中，將其轉(zhuǎn)移至石英扁平池中，在X波段電子自旋共振儀(Bruker ESP300)光照腔內(nèi)經(jīng)He-Ne激光器 (25 mW，663 nm，光斑直徑6 mm)光照3 min后，記錄捕獲自由基的ESR信號。參數(shù)設(shè)置如下：調(diào)制強(qiáng)度0.102 mT，調(diào)制頻率100 kHz，微波功率12.8 mW，放大倍數(shù)1.6×105，掃寬10 mT，掃描時間41.94 s，時間常數(shù)0.164 s。 自由基捕獲探針BMPO 參照文獻(xiàn)[17]方法合成。

1.5 類囊體膜的Urea-SDS-PAGE

電泳參照Laemmli[18]方法，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%，尿素濃度為6 mol/L。類囊體膜樣品加入2×樣品處理液后，37℃水浴1 h。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 室溫光照條件下電子傳遞鏈產(chǎn)生O2·－的spin trapping-ESR檢測

為鑒別O2·－與H2O2兩類活性氧分子對類囊體膜蛋白的損傷作用，首先需要對比分析野生型萊茵衣藻CC-125和過氧化氫酶缺失突變體CC-2913類囊體膜在光照條件下產(chǎn)生O2·－的規(guī)律。

正如圖1中ESR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在22℃恒溫條件下，將突變體CC-2913的類囊體膜（葉綠素濃度0.6 mg/mL）懸浮于含40 mmol/L自由基捕獲探針BMPO的SMN（pH 6.5）溶液中，光照3 min后可得加合物的ESR信號（參見圖1B）。該信號實(shí)測的波譜超精細(xì)耦合常數(shù)為：AN=1.36 mT，AH=1.06 mT，與文獻(xiàn)[19]中BMPO捕獲到超氧陰離子自由基所得ESR信號參數(shù)完全一致，可以相互印證；當(dāng)外加1 mmol/L TCNE到圖1B溶液體系后，發(fā)現(xiàn)ESR信號強(qiáng)度可增加2.5～3倍左右（圖1C）。這一增強(qiáng)效應(yīng)與作者前文[10]中采用自由基捕獲探針DEPMPO分析野生型萊茵衣藻CC-125的PSⅡ光照ESR結(jié)論相同。說明TCNE作為類囊體膜PSⅡ中具有內(nèi)源超氧化物歧化酶（SOD）活性的細(xì)胞色素b559(Cyt b559）的抑制劑，能夠通過將具有SOD活性的高氧化還原態(tài)Cyt b559轉(zhuǎn)變?yōu)椴痪逽OD活性的低氧化還原態(tài)Cytb559來抑制其內(nèi)源SOD活性[20]，大大增強(qiáng)其ESR信號；對比而言，在暗置條件下未能檢測到任何自由基的ESR信號（圖1A），說明圖1B～C所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基皆來源于類囊體膜內(nèi)光誘導(dǎo)電子傳遞反應(yīng)，也驗(yàn)證了Mehler反應(yīng)的經(jīng)典觀點(diǎn)[1]。

野生型萊茵衣藻CC-125和過氧化氫酶缺失突變體CC-2913類囊體膜在光照條件下產(chǎn)生O2·－信號強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果對比如圖1D所示。雖然在等葉綠素濃度條件下CC-2913的ESR平均信號強(qiáng)度（4,248±180.3）較CC-125（4,054.3±355.7）略高，但t檢驗(yàn)未見顯著差異。

2.2 萊茵衣藻類囊體膜光照產(chǎn)生H2O2的對比檢測

前期，作者對菠菜類囊體膜內(nèi)PSⅡ?qū)嶒?yàn)研究發(fā)現(xiàn)光照所產(chǎn)生超氧陰離子自由基可經(jīng)進(jìn)一步歧化反應(yīng)生成過氧化氫，在 3,000 μmol·m－2·s－1光強(qiáng)下照射 10 min，經(jīng) O2·－岐化產(chǎn)生H2O2的濃度可達(dá) 2.5 μmol H2O2·mg·Chl－1[6]。但考慮到 Mehler反應(yīng)位點(diǎn)還可能發(fā)生在 PSⅠ，因而不能排除其它H2O2產(chǎn)生途徑。

在上節(jié)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)光照野生型萊茵衣藻CC-125與過氧化氫酶缺失突變體CC-2913的類囊體膜所產(chǎn)生的超氧陰離子信號強(qiáng)度基本一致。那么經(jīng)此（PSⅡ內(nèi)由TCNE調(diào)控Cytb559途徑）O2·－歧化后產(chǎn)生H2O2的反應(yīng)規(guī)律會如何呢？為解答這一疑問，作者直接采用過氧化氫電極實(shí)測在相同He-Ne激光（25 mW，663 nm）照射條件下，CC-125與CC-2913的類囊體膜產(chǎn)生的H2O2濃度。

圖2 過氧化氫電極檢測CC-2913和CC-125類囊體膜光照產(chǎn)生的H2O2Fig.2 Direct detection of H2O2generated in thylakoid membranes ofCC-2913 and CC-125 under continuous illumination by hydrogen peroxide sensor(ISO-HPO-2)

如圖2所示，對野生型萊茵衣藻CC-125與過氧化氫酶缺失突變體CC-2913光照類囊體膜產(chǎn)生的H2O2濃度都遠(yuǎn)低于菠菜PSⅡ中的結(jié)果，其原因可解釋為類囊體膜遠(yuǎn)比PSⅡ顆粒的抗氧化防護(hù)體系完整，對H2O2的內(nèi)源性清除能力也更強(qiáng)。然而，當(dāng)TCNE加入后由O2·－歧化介導(dǎo)的H2O2信號明顯增加3倍左右。更為有趣的是，此時過氧化氫酶缺失萊茵衣藻突變體CC-2913比野生型CC-125所產(chǎn)生的H2O2也顯著增強(qiáng)，說明CC-2913類囊體膜內(nèi)內(nèi)源過氧化氫酶（CAT）活性比CC-125更低。此外，一旦外源性CAT（終濃度100 U/mL）加入CC-125/TCNE或CC-2913/TCNE光照溶液中，可見光照產(chǎn)生的信號陡然消失。這進(jìn)一步確鑿證明電流信號的記錄恰好反映H2O2濃度變化。

2.3 內(nèi)源性介導(dǎo)的光合系統(tǒng)蛋白組分損傷

突變體CC-2913缺乏過氧化氫酶，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)有較高濃度的過氧化氫。如果此時增加內(nèi)源性活性氧，很可能會對CC-2913細(xì)胞內(nèi)光合蛋白組分產(chǎn)生更大程度的損害。為檢驗(yàn)這一效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)源SOD抑制劑TCNE(終濃度為1 mmol/L)分別處理CC-125和CC-2913，在 50 μmol·m－2·s－1光照條件下培養(yǎng) 24 h 后，再依照 Selman-Reimer[15]方法提取出類囊體膜。最后分別對125、125+TCNE、2913、2913+TCNE光照培養(yǎng)提取物 (類囊體膜)進(jìn)行Urea-SDS-PAGE，電泳結(jié)果見圖3。

圖3 類囊體膜的Urea-SDS-PAGE 泳道125：未經(jīng)1 mmol/L TCNE處理的CC-125活體細(xì)胞提取的類囊體膜；泳道125+TCNE：經(jīng)過1 mmol/L TCNE處理24 h的CC-125活體細(xì)胞提取的類囊體膜；泳道2913：未經(jīng)1 mmol/L TCNE處理的CC-2913活體細(xì)胞提取的類囊體膜；泳道2913+TCNE：經(jīng)1 mmol/L TCNE處理24 h的CC-2913活體細(xì)胞提取的類囊體膜；每個泳道的蛋白上樣量為71.3 μg。泳道M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。Urea-SDS-PAGE的分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%，電泳后利用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行凝膠的染色。類囊體膜主要的蛋白組分名稱標(biāo)注于凝膠左側(cè)Fig.3 Urea-SDS-PAGE of thylakoid membranes Lane 125：Thylakoid membrane prepared from CC-125 cells without TCNE treatment;Lane 125+TCNE：Thylakoid membrane prepared from CC-125 cells treated with TCNE;Lane 2913：Thylakoid membrane prepared from CC-2913 cells without TCNE treatment;Lane 2913+TCNE：Thylakoid membrane prepared from CC-2913 cells treated with TCNE;Lane M：Protein molecular weight marker(Fermentas).Urea-SDS-PAGE was performed in a 15%(w/v)gel,after electrophoresis finished the gel was stained by coomassie brilliant blue.The major component of thylakoid membrane are marked at the left side of the gel

電泳結(jié)果顯示，未添加TCNE條件下，CC-125與CC-2913的類囊體膜的電泳條帶無顯著差異。這表明此環(huán)境下二者的氧化應(yīng)激水平都很低或發(fā)生自行修復(fù)，致使CC-2913和CC-125所受氧化損傷水平相差不大；對比而言，無論突變體CC-2913還是野生型CC-125細(xì)胞，經(jīng)1 mmol/L TCNE處理后所提取的類囊體膜蛋白中的特定蛋白條帶顏色會減弱。蛋白條帶減弱現(xiàn)象主要發(fā)生在功能蛋白組分 (如放氧復(fù)合體蛋白)，尤其對分子量25 kD以下的小分子量蛋白降解尤為明顯；而結(jié)構(gòu)蛋白受損情況相對較輕。此外，經(jīng)過TCNE處理的突變體CC-2913細(xì)胞比TCNE處理過的野生型CC-125細(xì)胞所提取的類囊體膜蛋白損傷更為嚴(yán)重。例如：放氧復(fù)合物OEC 23 kD和OEC 17 kD蛋白降解和脫落最為嚴(yán)重，對應(yīng)的電泳條帶已經(jīng)無法辨認(rèn)，顯示經(jīng)TCNE處理后的CC-2913細(xì)胞中OEC成為自由基攻擊的首要位點(diǎn)，這與文獻(xiàn)報道的ROS首先造成光合系統(tǒng)OEC破壞的結(jié)論完全一致[11]；又如通常用作高等植物光系統(tǒng)ROS損傷標(biāo)志物的D1蛋白，經(jīng)TCNE處理過后的CC-2913比CC-125樣品在條帶顏色上有所減弱。在萊茵衣藻細(xì)胞中，過氧化氫酶是最主要的H2O2清除酶[21]。而CC-2913缺乏過氧化氫酶，因而使得TCNE引發(fā)的H2O2損傷更為嚴(yán)重。遺憾的是，由于SDS-PAGE凝膠電泳分辨率有限，所得類囊體膜的D1蛋白條帶不甚清晰，難以對降解情況進(jìn)行更加準(zhǔn)確的描述。這有待后續(xù)的western-blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述D1蛋白的受損情況。

3 討 論

無論高等植物還是萊茵衣藻，其光合系統(tǒng)經(jīng)強(qiáng)光照射都可發(fā)生光系統(tǒng)功能的抑制，并且光抑制往往與ROS產(chǎn)生密切相關(guān)。人們最早認(rèn)識的ROS誘導(dǎo)的光系統(tǒng)抑制與損傷都與單線態(tài)氧有關(guān)。單線態(tài)氧活性極高，極易造成光系統(tǒng)蛋白的降解與修飾[22～24]；單線態(tài)氧可在PSⅡ受體側(cè)電子傳遞鏈上獲得泄漏的電子而產(chǎn)生超氧陰離子自由基，雖然O2·－活性也相當(dāng)強(qiáng)，但它較單線態(tài)氧的破壞能力減弱很多[4,23,25,26]，盡管如此，文獻(xiàn)中仍有人認(rèn)為O2·－也會損傷光系統(tǒng)蛋白[27]；O2·－的另一個特點(diǎn)是易岐化產(chǎn)生H2O2，而后者雖然性質(zhì)較O2·－更穩(wěn)定，但對光系統(tǒng)蛋白的直接或間接修飾與破壞作用可能會更強(qiáng)[23,28]。

圖4 衣藻葉綠體內(nèi)TCNE引發(fā)的內(nèi)源性超氧陰離子與過氧化氫產(chǎn)生示意圖Fig.4 Endogenous superoxide anion and hydrogen peroxide mediated byTCNE in chloroplast ofChlamydomonas reinhardtii

本工作通過對野生型萊茵衣藻CC-125和過氧化氫酶缺失突變體CC-2913的對比研究發(fā)現(xiàn)：雖然兩者在PSⅡ受體側(cè)電子漏產(chǎn)生超氧陰離子自由基的數(shù)量沒有顯著性差別，但由于突變體CC-2913內(nèi)缺乏過氧化氫酶活性導(dǎo)致生成更多的H2O2。進(jìn)一步的SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)明確顯示：由光誘導(dǎo)產(chǎn)物O2·－歧化生成的H2O2正是破壞光系統(tǒng)功能蛋白組分的罪魁禍?zhǔn)?，如D1、OEC 23 kD與OEC 17 kD蛋白等。盡管文獻(xiàn)中多數(shù)認(rèn)為H2O2比O2·－對PSⅡ破壞作用更占主導(dǎo)地位[11,12,26]，但進(jìn)一步參照作者關(guān)于ROS介導(dǎo)的PSⅡ放氧功能抑制的分子機(jī)制研究[6]和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以做出一致性的合理解釋：正是由于H2O2比O2·－相對性質(zhì)穩(wěn)定，且在膜結(jié)構(gòu)的葉綠體內(nèi)更易于擴(kuò)散與輸運(yùn)，所以它（或者伴隨產(chǎn)生的·OH自由基）對D1與OEC蛋白的破壞作用更為直接。換言之，產(chǎn)生于類囊體膜基質(zhì)（Stroma）一側(cè)的O2·－之自身性質(zhì)使得它對PSⅡ蛋白的破壞力較弱，但它可通過歧化產(chǎn)物H2O2間接破壞類囊體膜另一側(cè)（Lumen）的D1與OEC蛋白。

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This work was supported by a grant from The National Natural Science Foundation of China(20875093)

Damages to PSⅡComponent Proteins by Endogenous Superoxide Anion Radicals in Chlamydomonas reinhardtii

HE Zeng1,DU Libo2,JIANG Yugang2,CHEN Liangbing2,WANG Guangqing2,TIAN Qiu2,LIU Ke1,DU Linfang1,LIU Yang2
1.Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment,The Ministry of Education,College of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610064，China;
2.State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species,Institute of Chemistry,The Chinese Academy of Science,Beijing 100190，China

Mar 2,2010 Accepted：Mar 18,2010

LIU Yang,Tel：+86(10)62571074,E-mail：yliu@iccas.ac.cn;LIU Ke,Tel：+86(28)85415008,E-mail：liuke98@yahoo.com

Photoinitiated superoxide anion radical(O2·－)has been examined in thylakoid membranes isolated from Chlamydomonas reinhardtiiwild-type strains CC-125 and catalase-deficient mutant CC-2913,by spin trapping-ESR.Concentration of hydrogen peroxide(H2O2),produced from disproportionation of O2·－,was monitored by hydrogen peroxide sensor(ISO-HPO-2)under identical conditions.Urea-SDS-PAGE of thylakoid membranes further demonstrated that upon the addition of intrinsic SOD inhibitor tetracyanethylen(TCNE),ROS caused more damage to PSII components of CC-2913 than that of wild-type CC-125.It is concluded by comparing H2O2and O2·－,that although the original O2·－didn't directly cause damage to PSII components,the subsequently produced H2O2could trigger obvious damage to the PSII component proteins.

Chlamydomonasreinhardtii; Protein damage; Superoxide; Hydrogen peroxide; Thylakoid membranes

2010-03-02；接受日期：2010-03-18

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20875093)

劉揚(yáng)，電話：(010)62571074，E-mail：yliu@iccas.ac.cn；

劉科，電話：(028)85415008，E-mail：liuke98@yahoo.com

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