劉 悅,劉志強(qiáng),宋鳳瑞,劉淑瑩

(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所,長春質(zhì)譜中心,吉林長春 130022)

甘遂炮制的電噴霧質(zhì)譜研究

劉 悅,劉志強(qiáng),宋鳳瑞,劉淑瑩

(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所,長春質(zhì)譜中心,吉林長春 130022)

應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù),根據(jù)甘遂中巨大戟二萜醇型化合物在質(zhì)譜中離子強(qiáng)度的變化情況,采用正交實(shí)驗(yàn)法,優(yōu)化甘遂藥材醋炒和醋烘兩種炮制工藝的最佳炮制條件,并提出醋烘法的炮制工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:醋炒最佳炮制條件為30%醋量,悶制24 h,100℃炒25 min;醋烘最佳炮制條件為30%醋量,悶制24 h,110℃烘40 min。

甘遂;炮制;電噴霧質(zhì)譜

甘遂為大戟科大戟屬植物甘遂(Euphorbia kansuiT.N.Liou ex T.P.Wang)的干燥塊根,為我國傳統(tǒng)中藥,歷代本草皆有收載[1],分布于我國陜西、山西、河南等地[2]。具有瀉水逐飲、破積通便、消腫散結(jié)的功效,可用于治療惡性腫瘤、哮喘、慢性支氣管炎等癥狀?，F(xiàn)代藥理研究表明,甘遂具有抗生育、抗白血病、抗病毒等作用[3-5]。甘遂的活性與其含有的二萜類成分有關(guān),主要有巨大戟二萜醇型和假白欖酮型兩大類[6]。在先前的研究中,從甘遂中鑒定出一系列二萜化合物,示于圖1[7],其中巨大戟二萜醇型化合物是其抗腫瘤等作用的主要活性物質(zhì)。同時,甘遂還具有促癌活性和致突變作用,以及對免疫功能的抑制作用[8-9],巨大戟二萜醇型化合物也是毒性和刺激性的來源[10-11],其毒性和刺激性可能與其3位的取代情況有關(guān)[12]。甘遂苦寒有毒,作用猛烈,易傷人正氣。在傳統(tǒng)用藥過程中,多采用醋炙品入藥,起到降低毒性、減少烈性、改變甘遂的苦寒之性、增加溫性、緩和瀉下的作用[13-14]。2005年中國藥典記載的甘遂醋炙法為30%醋文火炒制[15],而對具體的炮制溫度、時間等條件未做說明。本工作嘗試采用質(zhì)譜法分析甘遂炮制作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),并以巨大戟二萜醇型二萜的離子強(qiáng)度的改變?yōu)橹笜?biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)法,對醋炒的炮制方法進(jìn)行條件優(yōu)化。此外,為了克服炒制法帶來的質(zhì)量控制不穩(wěn)定、易受人為影響等因素,嘗試采用烘制的方法炮制甘遂藥材,并對其溫度和時間等因素進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 甘遂氯仿萃取物的質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of chloroform extract from the roots ofEuphorbia kansui

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

FinniganLCQ離子阱型質(zhì)譜儀:美國Finnigan公司產(chǎn)品,電噴霧離子源。氯仿、二氯甲烷、提取用甲醇均為分析純;水為蒸餾水;質(zhì)譜分析用甲醇為色譜醇。甘遂根:2006年11月購自安徽厚樸藥業(yè)有限公司;米醋:鎮(zhèn)江恒豐醬醋有限公司產(chǎn)品(江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司監(jiān)制, 2006年10月20日,總酸≥3.60 g/100 mL,固態(tài)發(fā)酵)。

1.2 炮制條件

1.2.1 醋炒條件 采用以下工藝過程進(jìn)行甘遂醋炒炮制正交實(shí)驗(yàn):取9份甘遂,每份100 g,分別加入規(guī)定量的米醋(均稀釋至100 mL)拌勻,悶潤不同時間至醋被吸盡,在100℃的電磁爐上炒規(guī)定的時間,取出,陰涼干燥處晾干并保存,其正交實(shí)驗(yàn)因素水平列于表1。

1.2.2 醋烘條件 采用以下工藝過程進(jìn)行甘遂醋烘炮制正交實(shí)驗(yàn):取4份甘遂,每份100 g,分別加入30%米醋(均稀釋至60 mL)拌勻,悶潤不同時間至醋被吸盡,在不同溫度的烘箱中加熱規(guī)定的時間,取出,陰涼干燥處晾干并保存,其正交實(shí)驗(yàn)因素水平列于表2。

表1 醋炒法因素水平表Table 1 The factors and levels of vinegar-saute

表2 醋烘法因素水平表Table 2 The factors and levels of vinegar-preparing by oven

1.3 樣品制備

取10 g生甘遂及其炮制品,粉碎,加入10倍體積的水,回流提取1 h,離心10 min,轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1,上清液冷凍干燥。干燥樣品以100 mL二氯甲烷超聲20 min,溶解,過濾,合并濾液,28℃減壓蒸干。殘留物以二氯甲烷定容至10 mL容量瓶中,備用。以上各組樣品依上述步驟重復(fù)2次,結(jié)果以三者的平均值計算。質(zhì)譜測定時,采用連翹苷(50 mg·L-1)作為內(nèi)標(biāo),取100μL內(nèi)標(biāo)加入到20μL樣品中,并稀釋定容至0.5 mL,作為待測樣品。本研究中提到的相對離子強(qiáng)度為樣品中各組分離子的相對離子強(qiáng)度除以內(nèi)標(biāo)的相對離子強(qiáng)度所得的比值。

以上提取獲得的藥渣分別于陰涼通風(fēng)處干燥,以10倍體積的氯仿超聲提取50 min,過濾,藥渣以少量氯仿洗滌,合并濾液和洗滌液,28℃減壓蒸干,以二氯甲烷定容至10 mL容量瓶中,備用。取200μL內(nèi)標(biāo),加入到20μL樣品中,并稀釋定容至0.5 mL,作為待測樣品。

按醋炒和醋烘的最優(yōu)炮制條件(醋炒:30%醋量、悶制24 h、100℃炒25 min;醋烘:悶制24 h、110℃烘40 min)進(jìn)行樣品炮制,樣品制備同1.3操作。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)均采用正離子模式檢測。樣品以5μL·min-1直接噴霧電離,ESI源的各項(xiàng)參數(shù)為:噴霧電壓4.5 kV,加熱毛細(xì)管溫度200℃,毛細(xì)管電壓24 V,管透鏡補(bǔ)償電壓25 V,N2作為鞘氣和輔助氣,鞘氣流速為12 L· min-1,輔助氣流速為0。數(shù)據(jù)的采集和處理使用 Thermo Finnigan公司的Xcalibur軟件。

2 結(jié)果與討論

中藥炮制后療效、毒性及藥性的改變有其物質(zhì)基礎(chǔ),即化學(xué)成分的變化。多數(shù)的研究都是以中藥中少數(shù)幾個含量相對較高的有效成分或者毒性成分作為指標(biāo)來探討中藥炮制的機(jī)理[2]。但中藥含有的化學(xué)成分十分復(fù)雜,很多中藥的有效成分或毒性成分尚不清楚,其生物活性或者毒性還可能與很多微量成分有關(guān),因此,對中藥炮制的機(jī)理研究應(yīng)立足于整體成分的變化,深入探究炮制對中藥整體化學(xué)成分的影響,準(zhǔn)確地揭示炮制的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)理。而傳統(tǒng)分析方法往往不能鑒定其中的微量甚至痕量成分。近些年來,質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展,質(zhì)譜對化學(xué)成分的分析,特別是微量成分,具有快速、直觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本工作應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)研究中藥甘遂炮制前后化學(xué)成分的變化,為中藥炮制原理研究的深入做方法學(xué)方面的探索,進(jìn)而揭示中藥甘遂炮制的科學(xué)內(nèi)涵。

2.1 醋炒法

醋炒時,藥典規(guī)定甘遂炮制醋的用量是30%,為了探明不同醋量炮制對甘遂中巨大戟二萜類成分的影響差異,又另外選擇了15%和50%兩個比例的醋用量。

為了給甘遂炮制工藝現(xiàn)代化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù),避免傳統(tǒng)炮制過程中以經(jīng)驗(yàn)判斷作為炮制的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以甘遂原藥材與炮制品中主要的巨大戟二萜醇類化合物(化合物2～4、14～23、25～27、30～32;m/z877.5、929.5、931.8、501.1(2)、521.3(5)、563.2(3)、651.4、667.4 (2)、709.3、905.5、921.5;鈉加合離子)的相對離子強(qiáng)度變化的和(原藥材減去炮制品)為指標(biāo),應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法,選用L43表,對炮制的工藝進(jìn)行優(yōu)化。從圖2、圖3可以看出,炮制后水提物中主要的巨大戟二萜型化合物的總體強(qiáng)度比生品少,而假白欖酮型化合物[化合物5～6、9、34～39; m/z729.2、771.3、693.2、745.3(2)、799.1、800.2、753.2、816.2;鈉加合離子]的含量則有增有減,但相對于巨大戟二萜型化合物的變化來說,其變化不大。分析認(rèn)為主要存在兩方面的原因:一是加熱的炮制法使得沸點(diǎn)比較低的巨大戟二萜型化合物揮發(fā)或分解而損失,假白欖酮型化合物也可能受熱分解而損失;一是醋的加入增加了成分的溶出,由于對不同極性和類型的化合物,這兩方面的影響各不相同,共同作用的結(jié)果比較復(fù)雜。推測假白欖酮型化合物受二者影響差不多或者均較小,而巨大戟二萜型化合物可能受加熱時間(溫度一定)的影響更加明顯。

圖2 醋炒法對水提液中二萜化合物含量的影響Fig.2 The influence of vinegar-saute on the diterpenoid content in the aqueous extract

圖3 醋炒法對藥渣中二萜化合物含量的影響Fig.3 The influence of vinegar-saute on the diterpenoid content in the residue

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3,表4。從表中可以看出:對結(jié)果影響較大的因素為醋的用量。悶制和炒制時間越長,指標(biāo)成分減少得越多。但是,如果長時間加熱,藥材會發(fā)生焦糊等性狀改變,而指標(biāo)成分具有的一些藥理作用也會減弱。由于甘遂的傳統(tǒng)用藥形式有以丸散劑的形式入藥,而水提取法只是提取了其中的一部分成分,為了更加全面地的考察炮制對甘遂中化學(xué)成分的影響,對水提取后的藥渣成分進(jìn)行了類似的正交實(shí)驗(yàn)分析,結(jié)果列于表5、表6。從表中可以得出相同的優(yōu)化條件。由于實(shí)際用藥中,選用有機(jī)溶劑提取甘遂將使有毒的小極性巨大戟二萜等成分被大量提出,因此對于藥渣中成分的變化情況僅作參考。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定最佳炮制條件為30%醋量、悶制24 h、100℃炒25 min。

表3 醋炒法直觀分析表(水提液)Table 3 The visual analysis for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegar-saute(in the aqueous extract)

表4 醋炒法方差分析表(a=0.05)(水提液)Table 4 The analysis of variance(a=0.05) for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegar-saute(in the aqueous extract)

表5 醋炒法直觀分析表(藥渣)Table 5 The visual analysis for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegar-saute(in the residue)

表6 醋炒法方差分析表(a=0.05)(藥渣)Table 6 The analysis of variance(a=0.05) for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegar-saute(in the residue)

2.2 醋烘法

醋烘法中各組實(shí)驗(yàn)化學(xué)成分的變化示于圖4,圖5。從圖中可以看出:藥材水提物和藥渣中巨大戟二萜型化合物的含量比生品有不同程度的降低,特別是在藥渣中變化比較明顯,說明炮制起到了一定的減毒作用。而炮制品的假白欖酮型化合物的含量在藥渣中比生品有一定程度的降低;在藥材水提物中,除第二組炮制品外,也較生品有一定程度的降低,但總體變化不大。

圖4 醋烘法對水提液中二萜化合物含量的影響Fig.4 The influence of vinegar-preparing by oven the diterpenoid content in the aqueous extract

圖5 醋烘法對藥渣中二萜化合物含量的影響Fig.5 The influence of vinegar-preparing by oven the diterpenoid content in the residue

藥典規(guī)定甘遂炮制醋的用量是30%。王克周等[13]考察了醋制甘遂時不同醋量對其毒性及藥效的影響,認(rèn)為30%醋量醋制的甘遂毒性較小,利尿作用有所緩和,祛痰效果較強(qiáng)。因此,采用30%醋量進(jìn)行炮制,選用L32表進(jìn)行正交試驗(yàn)分析,其結(jié)果列于表7、表8。從表中可以看出:對結(jié)果影響比較大的因素為烘制溫度和烘制時間,而悶潤時間的影響相對小一些。藥渣的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表9,表10。從表中可以得出,同樣的最佳炮制條件,悶潤時間對結(jié)果的影響變大。綜上,醋烘最佳炮制條件為悶制24 h,110℃烘40 min。

表7 醋烘法直觀分析表(水提液)Table 7 The visual analysis for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegarpreparing by oven(in the aqueous extract)

表8 醋烘法方差分析表(a=0.05)(水提液)Table 8 The analysis of variance(a=0.05) for the change of the relative ion intensity of ingenane vinegar-preparing by oven (in the aqueous extract)

表9 醋烘法直觀分析表(藥渣)Table 9 The visual analysis for the change of the relative ion intensity of ingenane in vinegar-preparing by oven(in the residue)

表10 醋烘法方差分析表(a=0.05)(藥渣)Table 10 The analysis of variance(a=0.05) for the change of the relative ion intensity of ingenane invinegar-preparing by oven(in the residue)

用兩種炮制方法的最優(yōu)條件分別炮制甘遂,采用上述方法對其質(zhì)譜圖進(jìn)行比較,結(jié)果示于圖6。從圖中可以看出:在炒制法和烘制法得到的炮制品中,前者的巨大戟二萜含量稍高一些。

圖6 醋炒法和醋烘法最優(yōu)炮制條件二萜化合物的含量變化情況Fig.6 The comparison of the diterpenoid contents in the extract by vinegar-saute and vinegar-preparing by oven

3 結(jié) 論

本工作應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)優(yōu)化炮制條件,分析炮制的物質(zhì)基礎(chǔ),比較不同的炮制工藝。與傳統(tǒng)觀點(diǎn)相同的是:炮制后,水煎所獲得的刺激性和毒性成分(如巨大戟二萜型化合物)有一定的減少。因此以這些成分減少的程度為指標(biāo)來優(yōu)化炮制條件。由于假白欖酮型化合物是其活性成分,所以又考察了炮制后其含量的變化情況。這類化合物的量有一定的改變,但變化不顯著。對于生品和炮制品的水提物和藥渣中巨大戟二萜型化合物的研究證實(shí)了,炮制在一定程度上有降低毒性成分的作用。

炒制法和烘制法相比較,后者水提獲得的二萜較前者少。因此,無論從質(zhì)量可控的角度,還是從降低毒性的角度,烘制法要優(yōu)于炒制法。

綜上,推測炮制過程中既存在原有的二萜損失(伴隨著水和醋酸等成分的揮發(fā),這是一個成分減少的過程),又涉及化合物的轉(zhuǎn)化,一些無或弱毒性和刺激性的成分可能轉(zhuǎn)化(或熱裂解)為毒性或刺激性的成分。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析,認(rèn)為甘遂炮制減毒的可能機(jī)理主要包括以下幾點(diǎn):

1)加熱過程中的物理、化學(xué)轉(zhuǎn)化:部分巨大戟二萜醇酯發(fā)生揮發(fā);其分子內(nèi)脂肪酸位置轉(zhuǎn)移(例如,具有一定毒性和刺激性的3-?；マD(zhuǎn)化為無刺激性的20-酰基酯[12]);加熱過程中甘遂的部分化學(xué)成分與輔料中的成分(有機(jī)酸等)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),使有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒或無毒物質(zhì);熱/氧化降解等。

2)與醋中有機(jī)酸反應(yīng),生成的?；茦O性降低,從而降低水溶出度。

3)多數(shù)假白欖酮二萜極性要大于巨大戟二萜醇酯,前者分子中的活性羥基較少,含有的?；酁樾》肿拥囊阴；?、苯甲酰基、煙酰基等,結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定。受溫度、輔料的影響小,整體極性變化不明顯,因此炮制前后提取獲得的量的變化不顯著。

此外,多數(shù)二萜類化合物,特別是巨大戟二萜醇類化合物極性較小,因此水煎法提取的此類成分含量較低,與生品和炮制品的水煎劑毒性和刺激性均很低的報道是一致的[16]。此外,由于此類化合物的極性不大、紫外吸收較弱并且位于低波長端、水提取獲得的含量極少,應(yīng)用常規(guī)的正相和反相高效液相色譜分析存在很大的困難,而質(zhì)譜法的靈敏度比較高,同時可以獲得更多的化合物結(jié)構(gòu)信息,更加直觀、快速和全面。

對于甘遂的醇提法,根據(jù)二者的極性和溶解性等特性,得到的有毒成分和活性成分較水提法都將顯著增加。但對于炮制品,有研究表明,醇提物的毒性和刺激性,炮制品較生品低[16],但甘遂醇提入藥將導(dǎo)致中毒的可能性增加,臨床未見應(yīng)用。甘遂以丸散入藥和甘遂醇提入藥也不同,因此,對于臨床上甘遂以丸散入藥的情況還需要進(jìn)一步的研究。

中藥的化學(xué)組成、化學(xué)成分的性質(zhì)(極性、揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、溶解性)、不同化學(xué)成分的相互作用、溶劑的作用、炮制輔料的組成和作用、入藥方式(水煎和丸散等)、體內(nèi)代謝等都是十分復(fù)雜的,各因素之間共同作用的結(jié)果往往使得中藥炮制的機(jī)理變得更加復(fù)雜。因此,對于甘遂的炮制仍有很多的內(nèi)容需要做進(jìn)一步的深入研究。

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Optimization of Preparing Process Condition of K ansui Roots by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

LIU Yue,LIU Zhi-qiang,SONG Feng-rui,LIU Shu-ying
(Changchun Center of Mass S pectrometry,Changchun Institute of A pplied Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Changchun130022,China)

The preparing process condition of Kansui Roots was optimatived by electrospray ionization mass spectrometry technique and the cross experiment design method.According to the ion intensities changes of the ingenol compounds of the raw and processed roots of Euphorbia kansuiin ESI-MS spectra,two optimized vinegar-preparing condition were obtained respectively.The optimization conditions of vinegar-saute:dip in 30%vinegar for 24 h,saute in 100℃for 25 min;The optimization conditions of vinegar-preparing by oven:dip in 30%vinegar for 24 h,heat in 110℃for 40 min.

Euphorbia kansui;processing;electrospray ionization mass spectrometry(ESIMS)

O 657.63;R 284.1

A

1004-2997(2010)02-0072-07

2009-06-11;

2009-11-22

國家自然科學(xué)基金(No.30672600,No.30772721)資助

劉 悅(1978～),女(漢族),副研究員,從事天然藥物化學(xué)與中藥分析化學(xué)研究。E-mail:yh_zy@yahoo.com.cn

劉志強(qiáng)(1962～),男(漢族),研究員,博士生導(dǎo)師,從事天然藥物化學(xué)與有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail:liuzq@ciac.jl.cn