方閱 鄭恒 劉皋林

(1.上海市第一人民醫(yī)院藥劑科,湖北 武漢 200080;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥劑科,湖北 武漢 430030)

頭孢地尼(cefdinir)是口服第3代頭孢菌素類抗生素,通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而發(fā)揮抗菌作用[1]。本品抗菌譜較廣,對革蘭陽性和陰性細(xì)菌均有較好的抗菌作用;另外,頭孢地尼對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定,對一些產(chǎn)酶的細(xì)菌也有較好的抗菌作用[2]。因此,檢測頭孢地尼的藥代動力學(xué)情況及臨床血藥濃度的變化,可使臨床醫(yī)師更好掌握最佳的用藥時間,最佳、最有效的用藥劑量,以及把不良反應(yīng)降到最低而保持有效治療作用的最小用藥劑量,使其在臨床上得到更好、更有效地應(yīng)用。然而有關(guān)頭孢地尼血藥濃度的測定方法,國內(nèi)外雖已有相關(guān)文獻(xiàn)報道,如微生物方法[2]、液質(zhì)聯(lián)用法[3]及最先進(jìn)、最準(zhǔn)確的高效液相色譜(HPLC)檢測法,但此法檢測時間長[5]。為此,本研究建立了一種操作簡單、靈敏度高的測定血漿中頭孢地尼濃度的HPLC方法,以滿足該藥的臨床藥代動力學(xué)研究的需要。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑 頭孢地尼對照品(中國藥品生物制品檢定所,純度98.3%);內(nèi)標(biāo)甲硝唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所,純度100%);受試藥品頭孢地尼分散片(規(guī)格：0.1 g/片 ;批號：20090201;研制單位：深圳致君制藥有限公司);參比藥品頭孢地尼分散片(規(guī)格：50 mg/片;批號：070901;研制單位：天津市中央藥業(yè)有限公司)。乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司生產(chǎn));高氯酸(分析純,中國上海試劑總廠生產(chǎn));實驗用水(Milli-Q超純水)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀器：Waters液相色譜儀;色譜工作站(Empower Build 1154 software);SARTORIUS型 pH計(德國 sartorius公司);YKH-II型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);TGL-16G臺式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.3 色譜條件 Ultimate C18色譜柱(5 μ m,2504.6 mm);預(yù)柱為C18保護(hù)柱(43.0 mm I.D.,美國Phenomenex公司);流動相為乙腈：0.025 mol?L-1磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液(pH 3.24)=15∶85,流速為1.0 mL?min-1,檢測波長為286 nm,進(jìn)樣量為20μL,柱溫為35℃。

1.4 對照品溶液的制備 頭孢地尼標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取頭孢地尼對照品適量,以甲醇為溶劑溶解,依次定量配制 300、800、3000、8000 、10000、20000、25000 ng?mL-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液,置于-20℃保存。甲硝唑(內(nèi)標(biāo))溶液的配制：精密稱取甲硝唑適量,以甲醇為溶劑溶解,定量配制成9600 ng?mL-1溶液,作為內(nèi)標(biāo)貯備液,置于-20℃保存。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取血漿200μL,置1.5 mL的離心管中,精密加入20μL內(nèi)標(biāo)液(9600 ng?mL-1),渦旋混勻后,加20μL 35%高氯酸沉淀蛋白 ;渦旋 1 min,以 16600 r?min-1、4 ℃離心 10 min,取上清液 200μL至自動進(jìn)樣瓶中,取上清液20μL 進(jìn)行 HPLC測定。

2 結(jié) 果

2.1 方法專屬性 在本實驗所選色譜條件下,頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)峰形良好,其保留時間分別約為7.60 min和6.90 min,且血漿樣品經(jīng)處理后血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及其他藥物不干擾頭孢地尼的測定,見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 精密吸取空白血漿200μL,精密加入不同濃度的頭孢地尼標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL,配制成相當(dāng)于頭孢地尼血漿濃度為30、80、300、800、1000、2000、2500 ng ?mL-1的血漿樣品 ,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL起同樣操作;以待測物濃度為橫坐標(biāo),待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值f為縱坐標(biāo),對頭孢地尼血藥濃度做線性回歸。其結(jié)果表明,血漿中頭孢地尼血藥濃度30～2500 ng?mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,回歸方程為Y=0.7934C+0.0021,r=0.9999(n=6);定量下限為30 ng?mL-1。

2.3 精密度試驗 取空白血漿200μL,制備低、中 、高濃度(80、1000、2000 ng?mL-1)的質(zhì)控(Qc)樣品,連續(xù)測定3 d,根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算測得的濃度及精密度。其結(jié)果見表1。日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)均＜15%。

2.4 回收率試驗 在空白血漿中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液制備低、中、高濃度的Qc樣品,每一濃度制備并測定5個樣品。同時用流動相配制相同濃度的的樣品,每一濃度測定3個樣品。以經(jīng)沉淀蛋白處理后藥物峰面積與相同濃度流動相配置樣品直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比計算絕對回收率。其結(jié)果見表1。高、中、低3種濃度絕對回收率均＞60%,回收率良好。

表1 精密度和回收率試驗(n=5)()

表1 精密度和回收率試驗(n=5)()

濃度(ng?min/L-1)日內(nèi)精密度RSD(%)日間精密度RSD(%) 絕對回收率(%)80 3.02 9.00 76.41±6.631000 6.65 6.44 63.78±2.622000 0.97 3.89 66.44±2.29

2.5 穩(wěn)定性 取空白血漿 200μL,制備低、中、高濃度的Qc樣品。分別考察樣品在室溫放置2 h后、將預(yù)處理后的血漿樣品在室溫放置24 h后、頭孢地尼血漿樣品經(jīng)過 3次冷凍(-20℃)-解凍(室溫)循環(huán),以及在-80℃下放置30 d的穩(wěn)定性。結(jié)果如表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(,n=3)

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(,n=3)

濃度(ng?mL-1) 室溫放置2 h 室溫放置24 h 3次凍融 -80℃放置30 d 80 74.00±3.47 79.99±4.65 79.78±2.58 83.72±6.901000 957.43±40.64 965.53±37.56 925.87±76.92 1067.82±17.022000 1982.45±18.27 1806.10±216.30 1754.31±33.62 2031.65±42.52

2.6 生物等效性研究 本生物等效性試驗采用2制劑,2周期,隨機(jī)自身對照交叉試驗設(shè)計,20名健康男性受試者隨機(jī)分為2組,分別為受試制組和參比制劑組,每組10人,根據(jù)分組結(jié)果分別服用受試制劑或參比制劑,其血漿中頭孢地尼的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。血漿內(nèi)源性雜質(zhì)和其他藥物不干擾頭孢地尼的測定,因此,本方法符合生物樣本的測定要求,可用于頭孢地尼血藥濃度的測定和臨床藥代動力學(xué)研究。

圖1 血漿中頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)的色譜圖

圖2 20名受試者口服參比制劑和受試制劑后血漿中頭孢地尼的平均血藥濃度-時間曲線

3 討 論

頭孢地尼血藥濃度的測定有微生物法、液質(zhì)聯(lián)用法,但是上述方法對儀器要求高,所需成本也高。也有人采用HPLC法,但有樣品分析時間過長、樣本處理方法繁瑣、靈敏度低、回收率低、準(zhǔn)確性差及重復(fù)性差等問題,很難達(dá)到藥動學(xué)實驗所需的檢測線。本研究所用HPLC方法對這些問題做了大量的摸索、篩選,在確定內(nèi)標(biāo)、選用流動相、凈化樣品、去除雜質(zhì)等方面做了改進(jìn)。首先,在液相條件優(yōu)化過程中,本研究通過大量實驗篩選,最終選擇甲硝唑作為內(nèi)標(biāo)。甲硝唑在該實驗條件下響應(yīng)值高且穩(wěn)定,峰形好且不干擾頭孢地尼的測定,出峰時間與頭孢地尼相近,不影響樣本分析的時間。其次,在流動相的摸索過程中,先后選用了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-緩沖鹽溶液等作為流動相,發(fā)現(xiàn)乙腈-緩沖鹽溶液作為流動相較好,在此基礎(chǔ)上摸索乙腈和緩沖鹽的比例,流動相為乙腈∶0.025 mol?L-1磷酸二氫鈉緩沖鹽溶液(pH3.24)=15∶85時,頭孢地尼與內(nèi)標(biāo)分離好,峰形好且響應(yīng)高。再次,本方法采用高氯酸直接沉淀除去蛋白,樣品處理干凈且處理方法簡單、快捷,回收率高,靈敏度好。

經(jīng)過以上改進(jìn),本實驗條件下的定量下限僅為30 ng?mL-1,使測得的血藥濃度數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確,經(jīng)DAS軟件統(tǒng)計的藥代參數(shù)也更能反映頭孢地尼在健康人體內(nèi)的代謝情況,而且本研究樣本分析時間僅為11 min,大大節(jié)約了樣品分析的時間,適合藥代動力學(xué)研究大樣本分析的需要。

因此,本檢測方法操作簡單、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。在進(jìn)行藥代動力學(xué)研究時,無頭孢地尼代謝物和血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾,測定方法的特異性、精密度、準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性均符合生物樣本分析的基本要求,本研究建立的HPLC方法適用于頭孢地尼血藥濃度的測定和藥代動力學(xué)的研究。

1 Abdel NZ,Franco A,Jamal K.Comparative bioavailability of two cefdinir suspension formulations in middle eastern healthy volunteers after single oral adminisition[J].Antibiotics Antimycotics Antiviral Drugs Chemotherapeutics Cy tostatics,2008,58(3)：149-153.

2 馬瑞蓉,張慧琳,侯杰.頭孢地尼顆粒劑與膠囊的人體生物等效性[J].中國抗生素雜志,2002,27(11)：677-680.

3 Chen ZJ,Zhang J,Yu JC.Selective method for the determination of cefdinir in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2006,47(2)：163-169.