游游，朱琳，張艷，張游2,，唐學(xué)璽，肖慧*

1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，油脂加工廠以及餐飲業(yè)排出的油脂廢水量日益增多。直接排放的油脂廢水會(huì)飄浮于水體表面，影響水體的復(fù)氧及其自然凈化過(guò)程，危害水生生態(tài)系統(tǒng)，嚴(yán)重污染周?chē)h(huán)境[1-2]。

目前，油脂廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法由于投資大，占地廣，流程復(fù)雜，且容易產(chǎn)生二次污染，實(shí)際應(yīng)用較少[3]。而生物法處理油脂廢水，主要利用油脂廢水中的微生物具有一定的油脂降解能力，能將油脂作為碳源和能源，并通過(guò)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的脂肪酶等降解酶系的作用將油脂水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為水和二氧化碳等代謝產(chǎn)物[4-5]；整個(gè)處理過(guò)程投資小，成本低，效率高且無(wú)二次污染，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6-8]。

我國(guó)對(duì)油脂廢水的生物處理主要采用活性污泥法，然而傳統(tǒng)使用的活性污泥對(duì)含油廢水的直接處理能力較低、效果差[9]。因此從自然環(huán)境中篩選高效油脂降解菌，采用投菌法對(duì)活性污泥加以改善，對(duì)處理油脂廢水具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

采自中國(guó)海洋大學(xué)魚(yú)山校區(qū)快餐廳后下水道。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)液： NaCl 0.5 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏0.5 g，豆油按周期加入，pH 7.0～7.5，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

中性紅培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基加豆油10 mL，0.6%中性紅水溶液1 mL。121 ℃滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)液：蛋白胨1.0 g，NH4NO30.2 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，豆油1.0 mL，pH 7.2～7.4，蒸餾水1000 mL。121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 馴化

將采集到的樣品用無(wú)菌水 10倍稀釋后充分混合，制成樣液。取5 mL樣液到45 mL富集培養(yǎng)液中，30 ℃，140 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)，并同時(shí)做3個(gè)平行樣。每2 d觀察，若油脂降解效果好則適量補(bǔ)加豆油。每6 d為1周期，接種10 mL菌液到40 mL新培養(yǎng)液中以促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，馴化持續(xù)5個(gè)周期。初始加油量隨周期逐次遞增，分別為0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 mL·L-1。

1.2.2 油脂降解菌的分離

從馴化樣中選取油脂分解較充分的菌液，以最佳稀釋濃度 10-5稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑選不同形態(tài)特征的菌落，劃線純化培養(yǎng)。

1.2.3 油脂降解菌的篩選

將純化后的菌株接種于中性紅培養(yǎng)基上，觀察菌落周?chē)欠褡兗t，若變紅則表明菌株能夠分解油脂產(chǎn)生脂肪酸[10]。將初篩入選的菌株接種到以豆油為唯一碳源的選擇培養(yǎng)液中，30 ℃，140 r·min-1條件下培養(yǎng) 72 h，用紫外分光光度法[11]測(cè)定樣品在225 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，同時(shí)以豆油為溶質(zhì)石油醚為溶劑，測(cè)定不同豆油濃度的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含油量以及各菌株的油脂降解率，選取降解率最高的菌株作進(jìn)一步研究。

1.2.4 降解特性初步研究

從入選的菌種中挑取一環(huán)新鮮斜面種子，接種到不同初始 pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的選擇培養(yǎng)液中，140 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定油脂降解率，獲得最適降解pH值。同理，設(shè)定不同培養(yǎng)溫度：17、22、27、32、37、42 ℃，在最適pH值、140 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，獲得最適降解溫度，以及該條件下最佳降解率。

1.2.5 菌落形態(tài)觀察及生理生化特性研究

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上觀察入選菌株的菌落特征，并對(duì)菌株進(jìn)行一系列常規(guī)的生理生化實(shí)驗(yàn)[12][13]，初步確定菌株的分類(lèi)地位。

1.2.6 16S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析

采用CTAB法[14]提取細(xì)菌總DNA。利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系中含有：10×PCR緩沖液2.5 μL，1.5 mmol·L-1MgCl21.5 μL，4×dNTP混合物2 μL，引物各1 μL，2.5 U·μL-1的Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 1 μL，加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性6 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃溫育6 min。

擴(kuò)增后的16S rDNA純化后由上海桑尼生物公司測(cè)序，測(cè)得的序列提交到GenBank并在國(guó)際生物技術(shù)信息網(wǎng)中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行序列同源性分析，使用ClustalX1.8軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的16S rDNA序列進(jìn)行多序列比較，Mega3.0軟件中NJ法（鄰接法）構(gòu)建 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap檢驗(yàn)，重復(fù)1000次，確定該菌的分類(lèi)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及篩選

從中國(guó)海洋大學(xué)魚(yú)山校區(qū)快餐廳下水道采集到的樣液中經(jīng)1個(gè)月富集馴化共分離得到12株細(xì)菌，編號(hào) ss-1~ss-12。分離得到的菌株經(jīng)中性紅培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中9株細(xì)菌菌落周?chē)黠@變紅，初步斷定這9株菌能夠分解油脂產(chǎn)生脂肪酸，具有一定油脂降解能力。

將初篩獲得的菌株接種到選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后，測(cè)定含油量，計(jì)算油脂降解率。獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得到回歸方程：Y= 0.5066x + 0.0007，R2= 0.9999；各菌株的油脂降解率如圖2所示。

從圖2可以看出菌株ss-11的油脂降解率最高，達(dá)到47.29%，因此選取該菌株做進(jìn)一步研究。

2.2 菌株降解條件研究結(jié)果

2.2.1 最適降解pH值

相同溫度下，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖具有很大影響，每種細(xì)菌都有適合生長(zhǎng)的最適pH，且只能在一定pH條件下生長(zhǎng)繁殖。菌株ss-11在不同pH的選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后對(duì)油脂的降解率如圖3所示。圖3表明：pH值能顯著影響菌株ss-11對(duì)油脂的降解率，菌株在pH為5.0~9.0范圍內(nèi)均能降解油脂。當(dāng)pH值為7.0~8.0時(shí)菌株對(duì)油脂的降解率較高，幾乎達(dá)50%，pH過(guò)高過(guò)低，降解率都會(huì)降低，當(dāng)pH為5.0時(shí)，降解率不足20%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

圖2 各菌株的油脂降解率Fig.2 Oil-degrading rate of various strains

圖3 初始pH對(duì)降解率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on degradation rate

2.2.1 最適降解溫度

溫度影響著微生物體內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，它對(duì)生物有機(jī)體的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面，隨著溫度的上升，細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)速率和生長(zhǎng)速率加快；另一方面，機(jī)體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸和催化反應(yīng)的酶等對(duì)溫度都很敏感，隨著溫度的增高可能受到不同程度地破壞。因此，合適的溫度對(duì)菌種性能至關(guān)重要。菌株ss-11在pH為7.5，不同溫度條件下培養(yǎng)72 h后對(duì)油脂的降解率如圖4。圖4表明：溫度對(duì)菌株ss-11的油脂降解率影響顯著。在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的溫度范圍內(nèi)，菌株ss-11均能降解油脂；在37.0 ℃時(shí)降解率最高，達(dá)87.55%。隨著溫度上升或下降，降解率均有較大程度的下降，溫度為當(dāng)溫度為17.0 ℃，降解率僅為20%。即得出結(jié)論：在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，37 ℃下培養(yǎng)72 h，該菌的油脂降解率達(dá)87.55%。

圖4 溫度對(duì)降解率的影響Fig.4 Effect of temperature on decomposing rate

2.3 菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

菌落光滑呈圓形，較大，濕潤(rùn)，中間隆起，不透明，灰白色，無(wú)核，邊緣整齊。菌株成桿狀，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，革蘭氏染色陰性。葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、淀粉水解等實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株ss-11的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ss-11

根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)以及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]以及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版） 中相關(guān)描述，可將菌株ss-11鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。

2.4 菌株ss-11的16S rDNA基因序列

以菌株ss-11的DNA為模版，擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因序列，得到長(zhǎng)約1500 bp的16S rDNA片段，如圖5所示。擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序，測(cè)得其長(zhǎng)度為1425 bp，其GenBank序列號(hào)為GU993916。

圖5 菌株ss-11的16S rDNA片段擴(kuò)增電泳Fig.5 Electrophoresis of PCR products of 16S rDNA gene of strain ss-11

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將ss-11的序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast比對(duì)，其序列與產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca同源性達(dá)99%。選取6株同源性較高的菌株序列，再選取3株Klebsiella的其它菌株序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖6所示。

圖6 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的ss-11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence analysis

由 16S rDNA基因序列比較可知，菌株與 K.oxytoca親緣關(guān)系最接近。結(jié)合菌落形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將菌株 ss-11鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

3 討論

本研究從學(xué)校餐飲廢水中經(jīng)馴化、分離和篩選，獲得1株高效降解豆油的菌株ss-11，在初始豆油濃度為1.0 mL·L-1，初始pH為7.5，搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，37 ℃下培養(yǎng)72 h，該菌的油脂降解率達(dá)87.55%。經(jīng)過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，將該菌鑒定為產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）。

目前，已報(bào)道的降解油脂的細(xì)菌主要有假單孢菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微球菌屬（Micrococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、硫桿菌屬（Thiobacillus）和硝化桿菌屬（Nitrobacter）等[1,15,16]，其中降解豆油的菌株主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）[17]及淺白隱球酵母（Cyrptococeus albidu）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）[18]。尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）降解豆油的報(bào)道。此外，該菌可以在pH 6~10、溫度10~45 ℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，對(duì)外界環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗能力；且已報(bào)道的油脂降解菌大多為好氧菌[1]，而產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K. ooxytca）屬于兼性厭氧菌，對(duì)氧沒(méi)有強(qiáng)制性需求，適應(yīng)環(huán)境廣泛，這對(duì)于在缺氧等不利條件下油脂的降解十分有益。

本文篩選的油脂降解菌是從自然環(huán)境中獲取，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)、篩選和馴化得到的，通過(guò)對(duì)其16S rDNA序列分析確定其分類(lèi)地位并掌握該菌的生物學(xué)特性。今后對(duì)于該菌的研究可集中在對(duì)其進(jìn)行遺傳改造，探討不同油脂降解菌間的相互作用等方面，提高油脂降解率，以其應(yīng)用于油脂廢水的生物處理。

[1] 吳蘭, 葛剛, 羅玉萍. 油脂廢水的生物處理研究進(jìn)展[J]. 江西科學(xué),2003, 21(3): 317-320.LUO Lan, GE Gang,LUO Yuping. Recent progress on bio-degradation of grease-wastewater[J]. Jiangxi Science, 2003, 21(3): 317-320.

[2] WAKELIN N G, FORSTER C F. Aerobic treatment of grease-containing fast food: Restaurant wastewater[C]. Process safety and Environmental Protection Transactions of the Institution of Chemical Engineers, 1998, 76(1): 55-61.

[3] 閆亞娟. 高效油脂降解菌株的選育及其降解條件的初步研究[D].西安; 西北大學(xué), 2007.YAN Yajuan. Screening of highly effective oil-degrading strain and primary study of degrading condition[D]. Xian: Northwest University,2007.

[4] 張英, 秦華明, 朱明軍, 等. 高效油脂降解菌株的篩選及特性研究[J]. 工業(yè)用水與廢水, 2003, 23(2): 5-7.ZHANG Ying, QIN Huaming, ZHU Mingjun, et al. Selection of high-efficiency, oil-degrading strain and study of their characteristics[J]. Industrial Water & Waster Water, 2003, 23(2): 5-7.

[5] STEP HENSON T, MAN A, UPTON J. The small footprint waste-water treatment process[J]. Chemistry & Industry, 1993,19: 533.

[6] BECKER P, KOSTE K, POPOV M N, et al. The biodegradation of olive and the treatment of lipid-rich wool scouring wastewater under aerobic thermophilic conditions [J]. Water Research, 1999, 33(3):653-660.

[7] OKUDA S, ITO K ,OZAWA H, IZAKI K. Treatment of lipid-containing wastewater using bacteria which assimilate lipids [J].Bacterial treatment of lipid-waste.1991, 71(6):424-429.

[8] WAKELIN N G, FORSTER C F. An investigation into microbial removal of fats, oils and greases [J].Microbial treatment of fatty wastewater.1997, 59 (1):37-43.

[9] 胡玉潔, 郭興要, 楊鵬，等. 假絲酵母菌對(duì)高濃度油脂廢水的降解性能[J[. 工業(yè)水處理, 2004, 24(8): 46-51.HU Yujie, GUO Xingyao, YANG Peng, et al. Rapid biodegradation of wastewater containing highly concentrated lipids with a new Candida strain[J]. Industrial Water Treatment , 2004, 24(8): 46-51.

[10] 趙斌, 何紹江. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002:148-149.ZHAO Bin, HE Shaojiang. Microbiology Experiment[M]. Beijing:Science Press, 2002: 148-149.

[11] 沈叔平, 汪小梅. 廢水中動(dòng)植物油脂的紫外分光光度測(cè)定法[J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 1994, 10(3): 4-7.SHEN Shuping, WANG Xiaomie. Determination of animal and plant oils in the waste water by ultraviolet absorption spectrometry[J]. Environmental Monitoring in China, 1994, 10(3): 4-7.

[12] 東秀珠, 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[G]. 北京: 北京科學(xué)出版社, 2001, 2: 349-400.DONG Xiuzhu, CAI Miaoying. Identification Handbook of Common Bacterium System[M]. Beijing: Beijing Science Press, 2001, 2:349-400.

[13] 布坎南, 吉本斯, 等. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版. 科學(xué)出版社,1984, 500-502.BUCHANAN R E, GIBBONS N E. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology[M]. 8th ed. Beijing: Science Press，1984, 500-502.

[14] SAM BROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

[15] IJAH U J J, LI UKPE. Biodegradation of crude oil by bacillus strains 28A and 61B isolated from oil spilled soil[J]. Waste Management,1992, 12(1):55-60.

[16] 黃鈞, 白威, 李毅軍, 等. 3株油脂化工廢水降解菌的分離鑒定[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 1999, 5(supp1): 74-76.HUANG Jun, BAI Wei, LI Yijun, et al. Isolation and identification of three fatty-acid and fatty-amine degrading strains[J]. Chin J Appl Environ. Biol, 1999, 5(supp1): 74-76.

[17] 金建云, 李芳, 林開(kāi)春. 高效油脂降解菌的篩選及其降解影響因素的初步研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 25(4): 400-403.JIN Jianyun, LI Fang, LIN Kaichun. Screening of oil-degrading microorganism and the preliminary research on factors affecting the deg-radation[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2006, 25(4):400-403.

[18] 韓德軍, 潘麗梅. 餐飲廢水的微生物降解技術(shù)初步研究[J]. 東北師大學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 41(2): 182-185.HAN Dejun, PAN Limei. The primary research of the technique of the food waste water degradation by microbe[J]. Journa1 of Northeast Normal University:Natural Science Edition, 2009, 41(2): 182-185.