孫慶蘭，張 華，張西正，郭 勇，李瑞欣，戰(zhàn) 銳

（1.天津工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，天津 300160；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

內(nèi)皮細(xì)胞與小腸黏膜下層細(xì)胞相容性的初步研究

孫慶蘭1，張 華1，張西正2，郭 勇2，李瑞欣2，戰(zhàn) 銳3

（1.天津工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，天津 300160；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生裝備研究所，天津 300161；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050）

通過鹽溶液溶脹和酶液消化制備小腸黏膜下層基質(zhì)作為血管組織工程支架材料，將大鼠內(nèi)皮細(xì)胞接種于支架材料上，測定小腸黏膜下層基質(zhì)的細(xì)胞相容性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：內(nèi)皮細(xì)胞在小腸黏膜下層基質(zhì)上迅速鋪展增殖生長，在4 h時(shí)大約有96%的細(xì)胞黏附于材料上，MTT法結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞在支架上增殖生長明顯，活細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察表明細(xì)胞在支架材料上生長良好.

小腸黏膜下層；支架；內(nèi)皮細(xì)胞；組織工程

目前對(duì)血管移植物的需求不斷增大，組織工程方法可以較好地解決此問題[1].支架材料作為活細(xì)胞在體外生長時(shí)的支持物，在組織工程中占據(jù)很重要的位置.組織工程血管支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性，不易形成血栓等[2].30多年前有學(xué)者提出把小腸黏膜下層基質(zhì)（Small intestinal submucosa，SIS）作為血管支架材料[3].小腸黏膜下層是一種優(yōu)良的天然生物材料，來源廣泛，并且還具有良好的力學(xué)性能[4].雖然很多研究者都把SIS作為良好的組織工程血管材料，但是血管種子細(xì)胞和SIS的復(fù)合情況卻少有研究.本文采用處理過的SIS做支架，再種植血管內(nèi)皮細(xì)胞，測定細(xì)胞與材料的復(fù)合情況，并作相關(guān)的形態(tài)學(xué)觀察，可以為組織工程血管研究的發(fā)展提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料和設(shè)備

試驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)Wistar大鼠，雌雄不拘，體重150～180 g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

所用試劑包括：DMEM培養(yǎng)液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；胰蛋白液，美國GIBCO公司產(chǎn)品；凝血Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測試劑盒，武漢博士德公司產(chǎn)品；MTT，聯(lián)星生物公司產(chǎn)品.

所用儀器包括：超凈臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品；5%CO2培養(yǎng)箱，美國Forma公司產(chǎn)品.

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

斷頸法處死Wistar大鼠，無菌條件下快速取出胸段主動(dòng)脈放置于盛有D-hank′s的培養(yǎng)皿中；用鑷子去掉血管表面結(jié)締組織和脂肪組織，將血管縱行剖開，用剪刀將血管剪成1 mm3左右，將血管內(nèi)膜面貼于鼠尾膠原包被好的培養(yǎng)瓶內(nèi)[5]；加入2～3 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；翻轉(zhuǎn)干涸3～4 h后，輕輕翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng).6～7 d左右時(shí)去除組織塊并換液培養(yǎng)，以后每隔3 d換液1次.當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，以1∶2或1∶3的比例傳代，以獲得足夠量的種子細(xì)胞.取3～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 SIS制備

將新鮮的豬小腸用清水反復(fù)沖洗后，用裹有紗布的刀柄去除外面的漿膜層和肌層，翻轉(zhuǎn)后，去除黏膜層.經(jīng)50 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH處理16 h后，再用去離子水沖洗干凈.再經(jīng)1 mmol/L NaCl和1 mmol/L HCl處理8 h[6]，去離子水反復(fù)沖洗.1 mmol/L NaCl磷酸緩沖液處理16 h.0.25%胰酶和0.5%SDS分別處理24 h，去離子水沖洗.PBS浸洗6～8 h，0.3% H2O2浸泡6～8 h，去離子水浸洗4～6 h，凍干，置于-20℃溫度下保存.

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞與SIS材料表面黏附情況測定

將處理過的小腸黏膜下層處理成24孔板大小，鋪于孔板內(nèi)，經(jīng)紫外線照射滅菌后待用.將大鼠內(nèi)皮細(xì)胞消化成2.5×105個(gè)/mL，吸取100 μL加入各孔，分別在種植細(xì)胞1、2、4 h時(shí)，加入900 μL D-hank′s，輕輕吹打后取上清液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)而得到細(xì)胞貼壁數(shù)目.

1.5 MTT法測定內(nèi)皮細(xì)胞在SIS上的增殖情況

將處理過的小腸黏膜下層（SIS）處理成24孔板大小，并將其平整鋪于孔板內(nèi)，經(jīng)紫外線照射滅菌后待用.將大鼠內(nèi)皮細(xì)胞消化成4.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板內(nèi)，每孔接種200 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).于第1、3、5、7 d各取出1塊培養(yǎng)板，將接種有內(nèi)皮細(xì)胞的材料取出放入空白板內(nèi)，沿側(cè)壁緩緩加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液400 μL；然后加入100 μL的MTT（2 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h；然后小心吸出孔內(nèi)液體，每孔加入450 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min；將液體吸出，按每孔150 μL加入到96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定OD值.

2 結(jié)果與討論

2.1 SIS觀察

經(jīng)過鹽溶液溶脹和酶液消化法、PBS振蕩洗滌等步驟后制備成脫細(xì)胞小腸黏膜下層基質(zhì).支架材料行HE染色，見圖1（a），觀察得到支架材料脫細(xì)胞完全，無細(xì)胞或細(xì)胞碎片殘留，而圖1中（b）觀察得到SIS膠原保存良好.

圖1 小腸黏膜下層（SIS）光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Optical microscope image of small intestinal submucosa

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞與SIS材料表面黏附情況測定

雖然種子細(xì)胞的種植有多種方法，但是由于內(nèi)皮細(xì)胞是單層生長細(xì)胞，并且存在小腸黏膜下層基質(zhì)在溶液較多的情況下會(huì)漂浮起來等原因，為了保證細(xì)胞能夠最大程度地黏附于材料上，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法測定了細(xì)胞與支架材料黏附的最佳時(shí)間，測定結(jié)果如表1所示.

表1 內(nèi)皮細(xì)胞與SIS粘附率測定Tab.1 Rate of adhesion about ECs and SIS

由表1可見，內(nèi)皮細(xì)胞在1 h時(shí)貼壁數(shù)目就很多，達(dá)到了2.0×104個(gè)（共2.5×104個(gè)/孔），可見內(nèi)皮細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)就能很好地貼壁.在2 h和4 h時(shí)貼壁細(xì)胞數(shù)目都有相應(yīng)的增加，4 h時(shí)細(xì)胞黏附率達(dá)到96%左右.若在此時(shí)再補(bǔ)加培養(yǎng)液，細(xì)胞不會(huì)因?yàn)楦×Φ淖饔枚∮谂囵B(yǎng)液中，以致于難以貼壁生長.

2.3 MTT法測定內(nèi)皮細(xì)胞在SIS上的增殖

由于細(xì)胞計(jì)數(shù)法誤差很大，而通過MTT法測定細(xì)胞增殖情況，是目前為止使用較廣和比較可靠的方法之一.活細(xì)胞中的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙篆戭w粒，二甲基亞砜可溶解甲瓚顆粒，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量.而在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比.圖2所示分別為在第1、3、5、7 d時(shí)，以9×104/24孔板的密度種植在處理過的SIS材料表面的細(xì)胞MTT數(shù)值.

圖2 MTT法測定內(nèi)皮細(xì)胞在SIS上增值情況Fig.2 Proliferation of ECs on SIS by MTT methods

由圖2可以得出細(xì)胞增殖情況的趨勢，即隨著時(shí)間的延長而按成比例的增加.在第7 d時(shí)數(shù)值仍有所增加，說明在第7 d時(shí)細(xì)胞并未因長滿而出現(xiàn)生長停滯或者凋亡的現(xiàn)象.

圖3為在不同時(shí)間，EC與SIS支架材料復(fù)合過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察情況.

由圖3可以看出，血管內(nèi)皮細(xì)胞與SIS基質(zhì)復(fù)合的過程中，大鼠內(nèi)皮細(xì)胞在剛種植時(shí)，細(xì)胞多呈現(xiàn)出圓形狀；隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸在材料上延伸生長并增殖，呈現(xiàn)多角形，開始伸出偽足；第1 d時(shí)多數(shù)細(xì)胞在支架材料上鋪展開，呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀；第3 d時(shí)細(xì)胞已經(jīng)開始增殖；第5 d時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖，內(nèi)皮細(xì)胞在材料上生長良好，材料上有多個(gè)細(xì)胞密集區(qū)，表現(xiàn)出“鵝卵石”樣排列；第7 d時(shí)細(xì)胞生長良好，細(xì)胞分布比較均勻，鋪滿整個(gè)材料表面.

圖4所示為內(nèi)皮細(xì)胞種植支架材料后第5 d時(shí)的掃描電鏡照片.

由圖4可以看出，此時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)已經(jīng)粘連在一起，形成一定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).由于小腸黏膜下層是天然的生物材料，含有生物信息，能夠提供細(xì)胞所需的信號(hào)，推測其上所含有的部分生長因子能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在支架材料上的黏附與增殖.

圖3 EC與SIS材料復(fù)合過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測Fig.3 Cell morphology test of adhesion to ECs on SIS after implanted

圖4 組織工程化血管的掃描電鏡觀察Fig.4 SEM micrographs of tissue engineering blood vessels

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用鹽溶液和胰酶共同處理得到脫細(xì)胞小腸黏膜下層，細(xì)胞去除完全，纖維保存良好.大鼠內(nèi)皮細(xì)胞在SIS上黏附生長良好，說明SIS具有良好的細(xì)胞相容性，能夠促進(jìn)血管種子細(xì)胞在其上的黏附和增殖，可作為組織工程血管的支架材料.

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Primary research on cytocompatibility of endothelial cells and small intestinal submucosa

SUN Qing-lan1，ZHANG Hua1，ZHANG Xi-zheng2，GUO Yong2，LI Rui-xin2，ZHAN Rui3
（1.School of Science，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300160，China；2.Institute of Medical Equipment，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300161，China；3.Institute of Hygiene and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

As the scaffolds of the vascular tissue engineering，the small intestinal submucosas matrix are obtained by salt solution swelling and enzyme digestion，and vascular endothelial cells are isolated from the rat thoracic aorta and subcultureed and purified.The ECs are seeded on the surface of scaffolds to determine whether the scaffolds had the cytocompatibility.Experimental results show that the seeded endothelial cells proliferate rapidly on the small intestinal submucosa matrix.About 96%of the cells adhere to the surface of the material in the 4 hours after being seeded，and the Ecs grow obviously on scaffolds by the MTT method.The morphological observation of cells shows that cells grow well on the scaffold materials.

small intestinal submucosa；scaffolds；endothelial cells；tissue engineering

book=3,ebook=96

R318.08

A

1671－024X（2010）03－0071－03

2009-09-28 基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2005CB623904）

孫慶蘭（1985—），女，碩士研究生.

張 華（1961—），女，教授，導(dǎo)師.E-mail：hua1210@126.com