金海燕 周龍書 黃丕英

具有活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外部位時稱為子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT，簡稱內(nèi)異癥)。經(jīng)典的子宮內(nèi)膜種植學(xué)說提出，經(jīng)血中所含的子宮內(nèi)膜碎片可隨經(jīng)血逆流，經(jīng)輸卵管進入腹腔，種植于卵巢和鄰近的盆腔腹膜，并在該處繼續(xù)生長和蔓延，形成內(nèi)異癥。逆流入盆腔的內(nèi)膜細胞與腹膜粘附后，必須降解細胞外基質(zhì)才能植入腹膜［1］。組織蛋白酶D能降解細胞外基質(zhì)、糖蛋白及細胞連接，從而促進細胞侵襲，與乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2，3］。內(nèi)異癥具有侵襲性強，種植生長、遠處轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等類似惡性腫瘤的特點，被稱為是一種“良性癌癥”，其發(fā)生學(xué)上的子宮內(nèi)膜種植學(xué)說與腫瘤細胞的播散很相似［4］。因此，本研究測定組織蛋白酶D在正常子宮內(nèi)膜、內(nèi)異癥在位及異位內(nèi)膜中的表達，以探討組織蛋白酶D在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁、內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜取自11例育齡婦女，除子宮內(nèi)膜異位癥外，無其他內(nèi)、外科疾病。術(shù)前3個月內(nèi)未使用內(nèi)異癥治療藥物、性激素類藥物或放置宮內(nèi)節(jié)育器。其中內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜增殖期6例，分泌期5例。

1.1.2 正常子宮內(nèi)膜 取自月經(jīng)周期規(guī)律的育齡婦女，有正常妊娠生育史，末次月經(jīng)時間記憶準(zhǔn)確，因盆腔良性疾病行子宮切除術(shù)的非內(nèi)異癥患者。術(shù)前3個月內(nèi)未使用性激素類藥物或放置宮內(nèi)節(jié)育器，無其他內(nèi)、外科疾病。術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查子宮內(nèi)膜未發(fā)現(xiàn)病理學(xué)改變。其中增殖期11例，分泌期10例。

1.2 免疫組織化學(xué)方法 標(biāo)本行石蠟包埋，切片經(jīng)微波爐抗原修復(fù)20 min后用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶(SP)法進行染色。采用DAB同步浸染顯色法［5］使所有切片顯色時間相同。實驗設(shè)陽性對照及陰性對照。兔抗人組織蛋白酶D為Zymed Biotech產(chǎn)品，S-P免疫組化通用試劑盒為Maxin Biotech產(chǎn)品，均為即用型。

1.3 圖像分析 用陽性單位(positive unit，PU)定量表達免疫組化陽性反應(yīng)程度。將排除了切片本底因素后的純免疫組化反應(yīng)程度按灰度圖像分為0到100個等級，每一個等級定義為1個PU。PU值大小與陽性反應(yīng)程度成正比。在Leica Q550 IW圖像分析系統(tǒng)上測試在位和異位子宮內(nèi)膜腺上皮的灰度值 Gα和背景的灰度值 Gβ，按公式PU=［(Gα-Gβ)/Gmax］×100計算PU值。Gmax為檢測儀器的最大灰度，等于256。每張染色片隨機測試10個視場［6］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 10.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜腺上皮之間的比較采用單因素方差分析，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫異位腺上皮和同組患者在位子宮內(nèi)膜腺上皮之間的比較采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜組織蛋白酶D的表達 組織蛋白酶D主要表達于子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞和腔面上皮細胞，分散于間質(zhì)細胞，陽性產(chǎn)物主要位于胞漿內(nèi)。正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮的組織蛋白酶D存在明顯的周期性變化，分泌期明顯高于增殖期(P＜0.05)(圖1，圖2)。但內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的含量與同期正常子宮內(nèi)膜比較，差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的含量(PU，±s)

表1 正常子宮內(nèi)膜和內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的含量(PU，±s)

注:與組1相比較，aP＜0.01;bP=0.90;與組4相比較，dP＜0.01;cP=0.50

組別 例數(shù) 組織蛋白酶D正常增殖期子宮內(nèi)膜111 16.44±1.56正常分泌期子宮內(nèi)膜 2 10 19.93±2.42ac內(nèi)異癥在位增殖期子宮內(nèi)膜 3 6 16.54±2.20bd內(nèi)異癥在位分泌期子宮內(nèi)膜4520.50±1.81

2.2 內(nèi)異癥異位內(nèi)膜組織蛋白酶D的表達卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫中異位內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(PU=22.62 2.34)(圖3)，與同組患者的在位內(nèi)膜(PU=18.53 2.31)相比顯著升高(P＜0.05)。

圖1 內(nèi)異癥在位增殖期子宮內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(×100)圖2 內(nèi)異癥在位分泌期子宮內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的表達(×100)圖3 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫異位腺上皮組織蛋白酶D的表達(×250)

3 討論

子宮內(nèi)膜與腹膜建立接觸并進一步侵犯腹膜的機制是認識內(nèi)膜細胞異位種植的重要分子基礎(chǔ)。內(nèi)異癥患者的腹腔液中Ⅲ型膠原碎片增加，進一步說明內(nèi)異癥侵犯細胞外基質(zhì)而降解細胞外基質(zhì)成分的蛋白酶活性增強［7］。組織蛋白酶D是天門冬氨酸蛋白酶類的一種，屬酸性蛋白酶，也是一種溶酶體酶，廣泛存在于不同的組織細胞和腫瘤細胞，能催化降解細胞外基質(zhì)、糖蛋白及細胞連接，從而促進細胞侵襲。它是酸性環(huán)境中癌細胞分泌最多的蛋白水解酶，與許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究證實其活性與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)［2］。組織蛋白酶D的濃度與子宮內(nèi)膜癌侵襲深度呈正相關(guān)，與其分化程度呈負相關(guān)［3］。

本研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶D也表達于子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞，內(nèi)異癥在位內(nèi)膜腺上皮組織蛋白酶D的表達與正常子宮內(nèi)膜無明顯差異，但內(nèi)異癥異位腺上皮組織蛋白酶D的含量卻顯著高于內(nèi)異癥的在位內(nèi)膜。文獻報道，內(nèi)異癥患者的腹腔液中組織蛋白酶D含量也明顯增加［8］。組織蛋白酶D具有破壞宿主間質(zhì)天然屏障的作用，異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞通過組織蛋白酶D的高表達，使異位內(nèi)膜具有很強的蛋白水解能力，能夠降解異位內(nèi)膜周圍的基底膜及其他細胞外基質(zhì)成分，破壞腹膜基質(zhì)細胞的連接，進而侵犯腹膜及病灶周圍的結(jié)締組織，使異位內(nèi)膜在腹膜內(nèi)種植生長并使病灶不斷擴大。

［1］Kim HO，Yang KM，Kang IS，et al.Expression of CD44s，vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase-2 and Ki-67 in peritoneal，rectovaginal and ovarian endometriosis．J Reprod Med，2007，52(3):207-213．

［2］Ohri SS，Vashishta A，Proctor M，et al．The propeptide of cathepsin D increases proliferation，invasion and metastasis of breast cancer cells．Int J Oncol，2008，32(2)，491-498．

［3］Bradley WH，Lima PH，Rodgers L，et al．Endometrial carcinoma expresses an increased cathepsin B/D ratio．Gynecol Oncol，2008，108(1)，84-89．

［4］Quinn M．Endometriosis:the elusive epiphenomenon．J Obstet Gynaecol，2009，29(7):590-593．

［5］廖劍輝．DAB同步浸染顯色法在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用．暨南大學(xué)學(xué)報，1996，17:55-56．

［6］申洪．免疫組織化學(xué)染色定量方法研究(Ⅲ)．中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，1995，4(1):89-92．

［7］Pitsos M，Kanakas N．The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of endometriosis． Reprod Sci，2009，16 (8):717-726．

［8］Hudelist G，Keckstein J，Wright JT．The migrating adenomyoma:past views on the etiology of adenomyosis and endometriosis．Fertil Steril，2009，92(5):1536-1543．