陸燕, 易瑞灶, 陳偉珠

(國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361005)

堀越氏芽孢桿菌S184產(chǎn)河豚毒素的發(fā)酵條件優(yōu)化

陸燕, 易瑞灶, 陳偉珠

(國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361005)

采用快速有效的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)堀越氏芽孢桿菌(B acillus horikoshii)S184產(chǎn)河豚毒素的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。利用Plackett-Burman設(shè)計(jì),從眾多影響產(chǎn)河豚毒素的因素中篩選出影響較大的3個(gè)因素:蛋白胨、磷酸鹽質(zhì)量濃度和接種體積分?jǐn)?shù)。在此基礎(chǔ)上,再利用響應(yīng)面法中的雜合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化,通過擬合得到響應(yīng)曲面函數(shù),并獲得了最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在該實(shí)驗(yàn)條件下,河豚毒素產(chǎn)量從666.65 ng/L提高到1 900.60 ng/L。

優(yōu)化;河豚毒素;Plackett-Burman設(shè)計(jì);雜合設(shè)計(jì)

河豚毒素(TTX)是一種毒性很強(qiáng)的海洋生物活性物質(zhì),為非蛋白質(zhì)類神經(jīng)毒素,其分子中胍氨基是活性部位,胍氨基在生理?xiàng)l件下通過質(zhì)子化形成正電活性區(qū)域,與神經(jīng)和肌肉細(xì)胞膜表面的Na+通道上的專一性受體蛋白質(zhì)的負(fù)電性羥基結(jié)合,其周圍羥基以氫鍵形式與受體結(jié)合,這樣Na+通道被阻滯,從而影響神經(jīng)肌肉間興奮性的傳導(dǎo)[1-3]。它是神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究不可替代的工具藥,并已投入臨床使用。除此之外,TTX還具有降血壓、抗心律失常、緩解痙攣、鎮(zhèn)痛、局部麻醉等多種療效。尤為重要的是,它在用于抑制癌癥劇痛和戒毒時(shí),具有用量少、持效時(shí)間長且用后不成癮的優(yōu)點(diǎn),因而具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。

目前,國內(nèi)外所用的TTX大多是從河豚魚內(nèi)臟中提取的,這使得河豚魚資源日益稀少,藥源供應(yīng)受到限制。而多種產(chǎn)TTX微生物的發(fā)現(xiàn)[4-6],為TTX的生產(chǎn)提供了一個(gè)很好的潛在替代資源。作者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究中篩選到了一株堀越氏芽孢桿菌S184[7]。針對(duì)TTX產(chǎn)量低的問題,作者先用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響菌株S184產(chǎn)TTX的諸多因素進(jìn)行考察,從中篩選出最為重要的因素,再用雜合設(shè)計(jì)對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株堀越氏芽孢桿菌(B acillus horikoshii) S184,為作者在前期研究中篩選得到[7]。

1.2 初始培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為Zobell 2216E液體培養(yǎng)基,初始p H值為7.5。由平板挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基,200 r/min培養(yǎng)24 h。將種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接入發(fā)酵培養(yǎng)基,28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。以裝液量20%為基準(zhǔn),進(jìn)行培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3 發(fā)酵液中TTX的分離純化

發(fā)酵結(jié)束后,8 000 r/min離心15 min,上清液用醋酸調(diào)p H 4.0,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮約10倍,沸水浴10 min,8 000 r/min離心30 min,去除沉淀。上清液過活性炭柱,用1%醋酸(20%乙醇配制)洗脫,收集洗脫液,40°C減壓濃縮,去除乙醇,留下濃縮液少許,過SEP PA K C18小柱,用適量0.03%醋酸洗脫,洗脫液冷凍干燥,溶于少量0.03%醋酸,用于檢測。

1.4 TTX含量測定

儀器:Waters 2695,配有Waters 2475熒光檢測器;柱子:ZORBAX SB-C8柱(4.6 mm×250 mm, 5μm,Agilent);流動(dòng)相:0.05 mol/L Na2HPO4, 0.05 mol/L NaH2PO4,2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉;流速0.3 mL/min;柱后衍生試劑為4 mol/L NaOH;衍生化溫度110℃;檢測波長:激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長510 nm。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

作者以TTX產(chǎn)量為響應(yīng)目標(biāo),采用兩步法進(jìn)行優(yōu)化。首先利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出對(duì)響應(yīng)影響較大的因素,然后用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合,最終確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

1.5.1 篩選實(shí)驗(yàn)—Plackett-Burman設(shè)計(jì) Plackett-Burman設(shè)計(jì)由Plackett和Burman于1946年提出,它建立在不完全平衡板塊原理的基礎(chǔ)上,通過N個(gè)實(shí)驗(yàn)至多可以研究(N-1)個(gè)變量(N一般為4的倍數(shù))[8]。每個(gè)變量有高、低兩個(gè)水平,分別以+、-標(biāo)記。

作者考察8個(gè)因素,選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)安排見表1。每一行代表一次實(shí)驗(yàn),每一列表示一個(gè)考察的因素。各參數(shù)代表的變量及高低水平對(duì)應(yīng)的真實(shí)值見表2。

表1 N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Experimental design of Plackett-Burman with TTXconcentration as response

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素和水平Tab.2 The values of variables chosen for study versus the coded values of Plackett-Burman

1.5.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)曲面法是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法相結(jié)合的產(chǎn)物,它充分考慮了各個(gè)變量的交互作用,因此可以用來對(duì)人們感興趣的受多個(gè)變量影響的響應(yīng)問題進(jìn)行建模與分析,并可以將該響應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。雜合設(shè)計(jì)是由Roquemore[9]于1976年提出的,這種設(shè)計(jì)可以通過最少的實(shí)驗(yàn)來擬合二階的響應(yīng)面模型,前幾個(gè)因素具有5個(gè)水平,最后一個(gè)因素具有4個(gè)水平。

作者采用的雜合設(shè)計(jì)是Roquemore提出的R310型的設(shè)計(jì),具體設(shè)計(jì)方案見表3,各水平對(duì)應(yīng)的變量真實(shí)值見表4。

1.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)部分得到的多元函數(shù)進(jìn)行性狀分析,在有效范圍內(nèi)得到其極值點(diǎn),再按照該參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證模型的可靠性,并確定優(yōu)化結(jié)果。

表3 雜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣及TTX質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值Tab.3 Matrix for hybrid design with experimental and predicted values of TTXconcentration

表4 雜合設(shè)計(jì)各變量的高低水平對(duì)應(yīng)的真實(shí)值Tab.4 Actual values of variables versus coded values of hybrid design

2 結(jié)果與分析

2.1 影響菌株S184產(chǎn)TTX能力的重要因素的篩選

影響菌株S184發(fā)酵產(chǎn)TTX能力的因素有很多,主要有培養(yǎng)基的組成、p H值、NaCl質(zhì)量濃度、磷酸鹽質(zhì)量濃度、接種體積分?jǐn)?shù)、裝液量、發(fā)酵溫度等,其中,培養(yǎng)基的組成和p H值可直接影響細(xì)菌的生長和代謝;磷酸鹽的存在可影響細(xì)菌產(chǎn)TTX的能力,高質(zhì)量濃度的磷酸鹽抑制TTX的產(chǎn)生;由于菌株來源于海洋中的河豚魚,鹽質(zhì)量濃度會(huì)影響TTX的產(chǎn)生;接種量對(duì)菌體的生長有一定的影響;搖瓶中的供氧能力與裝液量密切相關(guān),而不同的溶氧條件會(huì)影響菌株的代謝途徑,從而影響TTX的產(chǎn)量。鑒于以上分析,作者確定了包括蛋白胨、酵母提取物、p H值、NaCl質(zhì)量濃度、磷酸鹽質(zhì)量濃度、接種量、裝液體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度等8個(gè)影響因素,選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)。按Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行二輪實(shí)驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液中TTX進(jìn)行分離純化,測定TTX質(zhì)量濃度,取二次測量值的平均值。分別計(jì)算各因素效應(yīng),結(jié)果見表5。

表5數(shù)據(jù)顯示:蛋白胨質(zhì)量濃度、磷酸鹽質(zhì)量濃度和接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株S184產(chǎn)TTX能力影響較明顯。因此,在后面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,將對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

根據(jù)效應(yīng)的正負(fù),其它因素確定為:NaCl 1 g/dL,酵母提取物0.1 g/dL,起始p H 7.5,裝液量20%,發(fā)酵溫度20℃。

表5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的效應(yīng)Tab.5 Effect estimates on TTXconcentration from results of Plackett-Burman design

2.2 響應(yīng)面的擬合以及最佳產(chǎn)TTX條件的確定

在篩選實(shí)驗(yàn)中,選出了3個(gè)待優(yōu)化的參數(shù),采用雜合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法僅需要10次實(shí)驗(yàn)即可完成優(yōu)化實(shí)驗(yàn),并可對(duì)響應(yīng)曲面函數(shù)進(jìn)行擬合。

由SAS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行擬合,得到二次響應(yīng)曲面函數(shù)為:

其中:X1、X2、X3分別代表蛋白胨質(zhì)量濃度、磷酸鹽質(zhì)量濃度和接種量的編碼值。對(duì)模型的方差分析結(jié)果見表6。模型對(duì)實(shí)際情況擬合很好,因此可以用方程(1)對(duì)菌株S184發(fā)酵產(chǎn)TTX的能力進(jìn)行分析和預(yù)測。

表6 菌株S184發(fā)酵產(chǎn)TTX量的方差分析和回歸分析Tab.6 ANOVA and regression analysis for TTX production by S184

用SAS軟件優(yōu)化條件組合,得到Y(jié)max= (1.736,-2.2E-16,-0.9273)=1 900.55。與此對(duì)應(yīng)的真實(shí)值是:蛋白胨質(zhì)量濃度0.747 2 g/dL,磷酸鹽質(zhì)量濃度0.006 g/dL,接種體積分?jǐn)?shù)1.145 4%,可使TTX產(chǎn)量達(dá)到最高。

2.3 擬合優(yōu)化的驗(yàn)證

根據(jù)篩選實(shí)驗(yàn)中確定的參數(shù)條件以及擬合優(yōu)化得到關(guān)鍵參數(shù)的最佳實(shí)驗(yàn)條件,確定了菌株S184產(chǎn)TTX的最佳條件為:蛋白胨0.747 2 g/dL,NaCl 1 g/ dL,酵母提取物0.1 g/dL,磷酸鹽0.006 g/dL,起始pH 7.5,裝液量20%,接種體積分?jǐn)?shù)1.145 4%,發(fā)酵溫度20℃。在該條件下,模型預(yù)測TTX產(chǎn)量為1 900.55 ng/L,實(shí)際測得為1 900.60 ng/L。

而初始條件下Y(0.5,2,1),即蛋白胨0.5 g/dL,磷酸鹽0.01 g/dL,接種體積分?jǐn)?shù)5%時(shí),模型預(yù)測TTX產(chǎn)量為666.23 ng/L,實(shí)際測得666.65 ng/L?？梢娫撃Ｐ湍茌^好地預(yù)測菌株S184產(chǎn)TTX的實(shí)際情況。優(yōu)化后的TTX產(chǎn)量比初始條件下提高了1.85倍。

3 結(jié) 語

常用的優(yōu)化手段(如單因素優(yōu)化法),往往忽略了各影響因素的交互作用,難以得到理想的優(yōu)化結(jié)果[10]。而當(dāng)考察因素較多時(shí),實(shí)驗(yàn)次數(shù)也會(huì)隨之大增。作者采用的Plackett-Burman設(shè)計(jì),是建立在不完全平衡板塊原理的基礎(chǔ)上,可以從眾多因素中快速、有效地篩選出最為重要的因素。近年來,該方法已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化[11-13]。而響應(yīng)面法中的雜合設(shè)計(jì)能以最經(jīng)濟(jì)的方式,以最少的實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行全面研究,使優(yōu)化后的TTX產(chǎn)量比初始條件下提高了1.85倍,達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。但是,要實(shí)現(xiàn)TTX的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn),其產(chǎn)量還有待進(jìn)一步提高。因此,在今后的工作中,必須對(duì)菌種進(jìn)行合理的高產(chǎn)育種,并深入研究TTX的生物合成機(jī)理,以便通過改變代謝途徑中各種酶的活性來提高TTX的產(chǎn)量。

[1]Kirsch G E,Shieh C C,Drewe J A,et al.Segmental exchanges define 4-aminopyridine binding and the inner mouth of K+pores[J].Neuron,1993,11:503-512.

[2]Scholz A,Vogel W.Tetrodotoxin-resistant action potential in dorsal root ganglion neurons are blocked by local anesthetics[J].Pain,2000,89:47-52.

[3]Narahashi T.Pharmacology of tetrodotoxin[J].J Toxicol-Toxin Rev,2001,20:67-84.

[4]Lee M,Jeong D,Kim W,et al.A tetrodotoxin-producing Vibrio strain,LM-1,from the puffer fishFugu vermicularis radiatus[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(4):1698-1701.

[5]Yu C F,Yu P H F,Chan P L,et al.Two novel species of tetrodotoxin-producing bacteria isolated from toxic marine puffer fishes[J].Toxicon,2004,44:641-647.

[6]Wang XJ,Yu R C,Luo X,et al.Toxin-screening and identification of bacteria isolated from highly toxic marine gastropodN assarius semiplicatus[J].Toxicon,2008,52:55-61.

[7]陸燕,易瑞灶.河豚魚體內(nèi)產(chǎn)河豚毒素海洋細(xì)菌菌株的篩選[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,24(Sup):179-181.

LU Yan,YI Rui-zao.Screening of tetrodotoxin-producing marine bacteria isolated from puffer-fish[J].Journal of Fujian Normal University:Natural Science Edition,2008,24(Sup):179-181.(in Chinese)

[8]Plackett R L,Burman J P.The design of optimum multifatorial experiments[J].Biometrika,1946,37:305-325.

[9]Roquemore K G.Hybrid designs for quadratic response surfaces[J].Technometrics,1976,18(4):419-423.

[10]Haaland P D.Statistical problem solving[M].New York:Marcel Dekker,1989:1-18.

[11]白東棟,吳堅(jiān)平,徐剛,等.響應(yīng)面法優(yōu)化烯丙醇酮乙酸酯水解酶的產(chǎn)酶條件[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,26(1): 71-76.

BAI Dong-dong,WU Jian-ping,XU Gang,et al.Optimization of the production conditions of HMPC hydrolase employing response surface methodology[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2007,26(1):71-76.(in Chinese)

[12]Reddy L V A,Wee YJ,Yun J S,et al.Optimization of alkaline protease production by batch culture ofBacillussp. RKY3 through Plackett-Burman and response surface methodological approaches[J].Bioresource Technology,2008,99: 2242-2249.

[13]Lu Y,Mei L H.Optimization of fermentation conditions for P450 BM-3 monooxygenase production by hybrid design methodology[J].Journal of Zhejiang University Science B,2007,8(1):27-32.

(責(zé)任編輯:李春麗)

Enhancement Tetrodotoxin Production fromBacillus horikoshiiS184 by Optimizing Nutrient and Environmental Conditions

LU Yan, YI Rui-zao, CHEN Wei-zhu
(Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration,Xiamen 361005,China)

In this manuscript,factorial design and response surface techniques were used to design and optimize the nutrient and environmental conditions for tetrodotoxin production fromB acillus horikoshiiS184.The content of peptone and phosphate,inoculum has been identified as three significant parameters for tetrodotoxin production by Plackett-Burman design.Based on those results,the optimum conditions were achieved by response surface techniques.With the optimum conditions,the yield of tetrodotoxin was increased to 1 900.60 ng/L from 666.65 ng/L.

optimization,tetrodotoxin,Plackett-Burman design,hybrid design

Q 93

:A

1673-1689(2010)02-0307-05

2009-07-01

福建省青年人才基金項(xiàng)目(2007F3059);國家海洋局第三海洋研究所專項(xiàng)資金項(xiàng)目(海三科2007014)。

陸燕(1978-),女,江蘇江陰人,工學(xué)博士,助理研究員,主要從事生物化工與發(fā)酵工程方面的研究。Email:hyss.yanlu@163.com