劉清岱, 王志偉, 安紅杰, 張治洲

(天津科技大學食品科學與生物技術學院,天津 300457)

用rpsL基因突變實驗評價丙烯酰胺致突變性的方法初探

劉清岱, 王志偉, 安紅杰, 張治洲

(天津科技大學食品科學與生物技術學院,天津 300457)

采用rpsL基因突變實驗對丙烯酰胺的致突變性進行了初步研究。實驗設0.05、0.10、0. 25、0.50、1.00 mg/mL 5個丙烯酰胺的劑量組和陰性、陽性對照組。結果發(fā)現,丙烯酰胺劑量組的突變頻率與陰性對照組相比均有顯著差異,并且有劑量效應關系,表明丙烯酰胺可誘發(fā)rpsL位點的突變。由于rpsL突變實驗自發(fā)突變背景水平低、靈敏度高,因此rpsL突變實驗有望成為食品和醫(yī)藥領域中致癌物快速檢測的有效工具。

rpsL基因突變;丙烯酰胺;致突變性

丙烯酰胺(acrylamide)作為工業(yè)加工合成聚丙烯酰胺的主要材料,廣泛應用于人類生產、生活和科研等領域。大量研究表明,丙烯酰胺不僅具有較強的神經毒性,而且也具有一定的致突變作用[1]。國際癌癥研究機構對其致癌性進行了評價,將丙烯酰胺列為二類致癌物[2]。近年來,瑞典和德國學者發(fā)現某些富含淀粉的食品在經過高溫加工處理后可檢測出丙烯酰胺,使得食品中丙烯酰胺的污染問題引起了國際社會和各國政府的高度關注[3-4]。然而,目前很少有文章從分子生物學角度對丙烯酰胺的致突變原理進行研究,因此有必要利用基因突變實驗研究丙烯酰胺的致突變性。

作者以質粒pMOL21的rpsL基因作為選擇標記進行致突變性的檢測。由rpsL基因編碼的核糖體蛋白S12可以與鏈霉素(Sm,streptomycin)形成復合物,并增強鏈霉素與細菌16S rRNA結合的能力,從而阻止了轉錄的起始,這就是鏈霉素藥理作用的基礎。若rpsL基因發(fā)生突變,將破壞16S rRNA與鏈霉素的相互作用,而導致細胞對鏈霉素產生耐藥性[5]。作者采用的宿主菌MF101的rpsL基因是突變的,具有鏈霉素抗性;而質粒pMOL21包含氨芐青霉素抗性和正確的rpsL基因序列。當pMOL21轉化入宿主細胞后,只有質粒的rpsL基因被誘發(fā)突變才會導致宿主細胞具備鏈霉素抗性(鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型),從而達到正向篩選突變rpsL基因的目的[6]。本研究的實驗方法是一種靈敏度高且簡便易行的體外短期致突變實驗方法,為檢測食品加工過程中產生的潛在致癌物提供了一種快速有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 細胞株和質粒DNA

大腸桿菌MF101:具有鏈霉素抗性,可進行rpsL突變型質粒的篩選;質粒pMOL21(4.1 kb),包含氨芐青霉素抗性和rpsL基因序列。菌株和質粒均由日本奈良科技大學Hisaji Maki教授贈予。

1.2 主要試劑

氨芐青霉素(Ap,ampicillin),鏈霉素(Sm, streptomycin),丙烯酰胺(acrylamide),溴化乙錠(EB)等:均購自上海生工生物工程技術公司。

1.3 感受態(tài)細胞的制備與轉化

采用CaCl2法制備感受態(tài)細胞[7],將質粒pMOL21轉化至大腸桿菌MF101,涂布在含氨芐青霉素(50μg/mL)的LB瓊脂平板上篩選轉化菌。

1.4 細菌的培養(yǎng)和丙烯酰胺質量濃度的確定

將帶有質粒pMOL21的大腸桿菌MF101培養(yǎng)至對數生長期(OD600為0.6左右),以1∶100的比例稀釋至含有丙烯酰胺的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng),并且以600 nm處的光吸收值測定大腸桿菌的生長曲線。

丙烯酰胺設0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL共5個劑量組;以溴化乙錠(EB)作陽性對照,終質量濃度為0.1 mg/mL;以無菌的去離子水作為陰性對照。各組均培養(yǎng)10 h后用于rpsL突變頻率的測定。

1.5 rpsL基因突變頻率的測定

將細菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板(50 μg/mL)上來確定轉化細胞的總數;涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素(50μg/mL)平板上以確定rpsL基因突變的總數。突變率是突變菌數(含Ap和Sm平板的菌數)/總菌數(含Ap平板的菌數)。每組至少3次重復,總菌落數不低于106個,用SAS 8.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 丙烯酰胺對大腸桿菌生長的影響

研究了不同濃度的丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21生長在不同時間的影響,所得結果見圖1。從圖1可看出,對照組的大腸桿菌細胞振蕩培養(yǎng)達到穩(wěn)定期的時間約為7 h。隨著丙烯酰胺劑量的增加,達到穩(wěn)定期的時間有所延長,當丙烯酰胺質量濃度達到1 mg/mL時,大腸桿菌細胞振蕩培養(yǎng)達到穩(wěn)定期滯后到10 h左右。細胞對數生長期的延長,表明了一定質量濃度的丙烯酰胺抑制了大腸桿菌細胞的生長,對于大腸桿菌具有明顯的細胞毒性。

圖1 丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21生長的影響Fig.1 Effects of acrylamid onE.coliMF101/pMOL21 growth

2.2 丙烯酰胺誘發(fā)的rpsL位點的突變頻率(Mutation Frequency,MF)

研究了不同質量濃度的丙烯酰胺對大腸桿菌MF101/pMOL21的rpsL位點的誘導突變頻率,所得結果見表1。在以水作為陰性對照測定的rpsL基因的自發(fā)突變率為1.85×10-6,這與日本奈良科技大學Hisaji Maki報道基本是一致的[8]。作者選擇分子生物學實驗室常見的誘變劑EB作為陽性對照,在較低質量濃度下(0.01 mg/mL)即顯示出強的致突變性,陽性對照組突變頻率是陰性對照的6倍以上。

表1 丙烯酰胺誘發(fā)的rpsL基因突變頻率Tab.1 TherpsLgene mutation frequencies induced by acrylamide

從表1中可以看出,不同質量濃度的丙烯酰胺下的突變頻率具有一定的劑量反應關系。為此,作者將這些數據進行了回歸分析,所得結果見圖2。

圖2 rpsL基因突變頻率與丙烯酰胺濃度的關系示意圖Fig.2 Effects of acrylamide on therpsLgene mutation frequencies

從圖2可以看出,丙烯酰胺的不同劑量組與對照組相比均有顯著性差異,并且有劑量反應關系。各質量濃度的丙烯酰胺與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05),該檢驗線性顯著(R2=0.945,F= 87.26)。

3 結 語

本研究中陽性對照組rpsL基因的突變頻率是陰性對照的6倍以上,根據rpsL基因突變實驗成立的條件判斷,實驗結果是可靠的。隨著丙烯酰胺作用劑量的增加,rpsL位點的突變頻率顯著增加,并且有劑量效應關系,表明丙烯酰胺可以誘發(fā)rpsL位點的突變。值得關注的是,質量濃度為0.05 mg/ mL的丙烯酰胺組和對照相比也呈現了顯著的差異,說明了該系統(tǒng)具有高度的靈敏性。

目前rpsL基因正向選擇系統(tǒng)主要應用于DNA聚合酶擴增產物突變率的檢測[9]。國內有關利用rpsL基因進行細菌耐藥性的研究進行得很多,但是還沒有利用該系統(tǒng)定量測定化合物的致突變性。常用的致突變性評測系統(tǒng)主要采用哺乳類細胞正向突變實驗,即HPRT基因突變試驗和TK基因突變實驗[10-11]。但是這些實驗均需要復雜的哺乳細胞培養(yǎng)條件,且實驗過程大多在10 d以上。采用rpsL系統(tǒng)進行檢測,整個分析過程可以在24 h內實現。同時rpsL分析背景較低,如TK基因的自發(fā)突變率為10-5[11],而rpsL的自發(fā)突變率低至10-6,遠低于同類正向篩選體系。此外,采用rpsL正向選擇系統(tǒng)進行丙烯酰胺導致的突變性的評價不需要復雜的實驗條件,節(jié)省人力物力。因此rpsL基因突變實驗有望成為食品和醫(yī)藥領域中致癌物快速檢測的有效工具。

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(責任編輯:李春麗)

Application ofrpsLMutation Assay for Mutagenicity with Acrylamide

LIU Qing-dai, WANG Zhi-wei, AN Hong-jie, ZHANG Zhi-zhou
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)

In this study,rpsLmutation assay was use as model to determine the mutagenicity induced by acrylamide.E.coliMF101 carried with pMOL21 was treated with different concentrations of acrylamide(0.05,0.10,0.25,0.50,1.00 mg/mL,respectively).The results showed that with the increasing of the acrylamide concentration,rpsLmutation frequency significantly increases.Furthermore,a dosage-dependent relationship was detected.The results present here strong suggested that therpsLmutation assay may be as a potential tool for investigating food and drug safety.

rpsLmutation assay,acrylamide,mutagenicity

TS 201.6

:A

1673-1689(2010)02-0298-04

2009-07-08

國家自然科學基金項目(30800255);教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃;天津科技大學人才引進基金項目(20060432,20060424)。

劉清岱(1975-),男,滿族,河北保定人,講師,理學博士,主要從事生物化學與分子生物學方面的研究。Email:lqd@tust.edu.cn。