金光澤, 段作營(yíng), 張蓮芬, 金堅(jiān), 李華鐘＊

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

重組融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突變體在畢赤酵母中的表達(dá)

金光澤1, 段作營(yíng)1, 張蓮芬2, 金堅(jiān)2, 李華鐘＊1

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

構(gòu)建編碼人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重組表達(dá)質(zhì)粒,在Pichia pastorisGS115中表達(dá),獲得具有較高IL-2活性的融合蛋白。設(shè)計(jì)并合成符合P.pastoris密碼子偏好,且含有C125A突變的IL-2編碼基因IL-2m,通過(guò)酶切連接方法將其與人血清白蛋白(HSA)的編碼基因連接為融合蛋白HSA-IL2m的編碼基因?？寺〉奖磉_(dá)質(zhì)粒pPIC9K中,電擊轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。搖瓶發(fā)酵獲得分泌表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果:Western blot鑒定結(jié)果顯示該融合蛋白與IL-2、HSA的抗體都能發(fā)生免疫反應(yīng)。經(jīng)脫鹽、凍干制備的粗蛋白的IL-2生物學(xué)活性為1.51×106IU/mg。結(jié)論:在P.pastorisGS115中成功表達(dá)了具有人白介素-2生物學(xué)活性的HSA-IL2m融合蛋白。

突變型人白介素-2;人血清白蛋白;畢赤酵母;融合蛋白

白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2),又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子,1976年由Morgan等首先在外周血淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1],是輔助T細(xì)胞分泌的淋巴因子,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。它是中國(guó)第一個(gè)基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物[2],臨床上可用于惡性腫瘤治療、感染性疾病的治療、鎮(zhèn)痛等[3]。由于IL-2在人體內(nèi)的半衰期很短,臨床多采用高劑量頻繁給藥,這不僅增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)更有可能產(chǎn)生不良副作用[4]。為了克服上述缺點(diǎn),作者利用人血清白蛋白融合技術(shù)(albumin fusion technology)構(gòu)建了編碼人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)和IL-2的融合基因,通過(guò)分泌型表達(dá)載體pPIC9K,將該融合基因整合到巴斯德畢赤酵母染色體中,在分泌信號(hào)肽的作用下分泌表達(dá)融合蛋白HSA-IL2,以增加其半衰期。同時(shí),為了能夠大量生產(chǎn)具有較高的IL-2活性的融合蛋白,對(duì)IL-2分子的編碼序列進(jìn)行了改造。IL-2的成熟分子由133個(gè)氨基酸殘基組成,它剪切掉了IL-2 N-端20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,翻譯后加工的過(guò)程還包括在58位和105位半胱氨酸(Cys)之間形成二硫鍵,正確的二硫鍵對(duì)于IL-2活性的保持是必需的[5],而肽鏈中第三個(gè)Cys位點(diǎn)的存在極有可能造成二硫鍵的錯(cuò)配產(chǎn)生無(wú)活性異構(gòu)體和多聚體。根據(jù)畢赤酵母密碼子使用頻率,替換天然IL-2編碼序列中的低頻密碼子,并設(shè)計(jì)合成了第125位游離Cys點(diǎn)突變?yōu)锳la的突變型人白介素-2(mutant Interleukin-2, IL2m)的編碼基因。再通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化,得到較高的融合蛋白產(chǎn)量及生物學(xué)活性。

1 材 料

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

大腸桿菌Escherichia coliXL1-Blue和含有HSA編碼基因的質(zhì)粒pBlue/HSA為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存,畢赤酵母Pichia pastorisGS115和酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司, IL2m的編碼基因委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 酶和其他試劑

Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit(OMEGA BIO-TEK),限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、 Taq DNA Polymerase、PCR試劑:Takara寶生物公司產(chǎn)品;Interleukin-2 Antibody(sc-34799):Santa公司產(chǎn)品;Donkey anti-Goat/HRP(KC-GT-035):上?？党缮镉邢薰井a(chǎn)品;HSA兔抗人多克隆抗體:作者所在實(shí)驗(yàn)室制備;Goat anti-Rabbit IgG/ HRP(bse-0295G):北京博奧森公司產(chǎn)品;脲微量白蛋白測(cè)定試劑盒:上海名典生物公司產(chǎn)品;其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,p H 7.2;固體LB培養(yǎng)基添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的瓊脂;

酵母培養(yǎng)基YPD、MD、BMGY、BMMY、YPD按照文獻(xiàn)[6]方法配制。

2 方法

2.1 融合蛋白基因的克隆

2.1.1 IL2m基因的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中天然IL-2編碼基因序列,根據(jù)http://www.kazusa.or.jp/codon/數(shù)據(jù)庫(kù)提供的Pichia pastoris密碼子信息,保留天然IL-2編碼基因中的高頻及次高頻密碼子,用高頻密碼子替換剩余的所有低頻密碼子,并突變天然IL-2第125位Cys為Ala。設(shè)計(jì)如下序列:

其中S1為設(shè)計(jì)合成序列,S2是天然IL-2的編碼序列。S1的5’端序列GCCTTA GGCTTA為人血清白蛋白的編碼基因3’末端的序列,下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),TAA是終止密碼,兩者之間的396個(gè)堿基為IL2m的編碼序列。全部序列長(zhǎng)423 bp,交由上海生工生物工程公司合成并克隆到載體pUC57中。

2.1.2 HSA-IL2m融合蛋白的表達(dá)基因的構(gòu)建質(zhì)粒pBlue/HSA經(jīng)Eco81I、NotI雙酶切,回收含有HSA序列的載體片段。質(zhì)粒pUC57-IL2m經(jīng)Eco81I、N otI雙酶切,回收IL2m片斷,連接兩片段后,轉(zhuǎn)化E.coliXL1-Blue,根據(jù)Amp抗性挑選轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒,酶切驗(yàn)證,得到含有人血清白蛋白-人白介素2C125A(HSA-IL2m)的序列的重組質(zhì)粒pBHIm。

2.1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒pPIC9k和pBHIm經(jīng)EcoRI、N otI雙酶切,回收兩片斷,連接后,轉(zhuǎn)化E.coliXL1-Blue,根據(jù)Amp抗性挑選轉(zhuǎn)化子

pPHIm。提取質(zhì)粒,酶切驗(yàn)證,并送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2.2 融合蛋白表達(dá)與鑒定

2.2.1 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒pPHIm經(jīng)S alI酶切,回收線性化片斷,電擊轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115。感受態(tài)細(xì)胞的制備方法及酵母轉(zhuǎn)化方法同參考文獻(xiàn)[7]。

2.2.2 重組克隆篩選及產(chǎn)物表達(dá) 將電擊轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞以合適的稀釋度涂布含有1 mol/L山梨醇的MD平板,30℃培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。初篩:挑取長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子200個(gè),接種到含5 mL BMGY培養(yǎng)基的試管中,30℃,200 r/min培養(yǎng)36 h。置于4℃冰箱中待菌體自然沉降,無(wú)菌條件下棄上清,加入1 mL BMMY培養(yǎng)基,30℃,200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h,其間每隔24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%甲醇。5 000 r/ min,5 min離心收集上清,用脲微量白蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液中目標(biāo)蛋白的量,選取高表達(dá)量菌株,于YPD斜面4℃保藏。復(fù)篩:挑取上述初篩的菌至5 mL BMGY培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中,30℃,200 r/min培養(yǎng)24 h,以體積分?jǐn)?shù)1%接種量轉(zhuǎn)接到裝有100 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,200 r/min培養(yǎng)30 h左右,離心收集菌體于裝有25 mL BMMY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng),30℃,200 r/min誘導(dǎo)72 h,其間每隔24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%甲醇。5 000 r/min,5 min離心收集發(fā)酵上清液。結(jié)合脲微量白蛋白測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE電泳,挑選表達(dá)量最高菌株,于YPD斜面4℃保藏。

2.2.3 重組子誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的分析與Western blot驗(yàn)證 取保存的發(fā)酵上清液,經(jīng)SDS-PA GE后,電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上,用含50 g/L脫脂奶粉的1×TBS緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,15 mmol/L NaCl,p H7.5)4℃封閉過(guò)夜,用TBS清洗后分別用兔抗人HSA或山羊抗人IL-2的抗體(1: 100)室溫孵育2 h,用TBS清洗后分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1:500)或驢抗山羊二抗(1:500)室溫孵育1 h,用TBS清洗后用DAB試劑顯色。

2.2.4 活性測(cè)定 根據(jù)中國(guó)藥2005年第三部中關(guān)于IL-2的生物活性的檢測(cè)方法,即CTLL-2/ MTT法[8],對(duì)融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。文中沒有說(shuō)明的其他分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法,均參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

2.2.5 融合蛋白的搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)條件初步優(yōu)化菌體培養(yǎng)及誘導(dǎo)的方法同2.2.2中復(fù)篩時(shí)所用的兩步法。采用單因素實(shí)驗(yàn),根據(jù)優(yōu)化需要進(jìn)行相關(guān)調(diào)整,研究初始p H、甲醇加量、轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)相與生長(zhǎng)相培養(yǎng)基體積比等4個(gè)主要條件對(duì)HSA-IL2m表達(dá)量的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 融合蛋白基因的構(gòu)建

質(zhì)粒pBlue/HSA經(jīng)Eco81I、N otI雙酶切,回收約4.7 kb的片斷;質(zhì)粒pUC57-IL2m經(jīng)Eco81I、N otI雙酶切,回收0.4 kb的片斷。利用這兩個(gè)片斷雙酶切所形成的粘性末端,連接后轉(zhuǎn)化E.coliXL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,通過(guò)Amp抗性挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證,結(jié)果如圖1所示,重組質(zhì)粒pBHIm經(jīng)EcoRI單酶切得到5.1 kb的片斷,比質(zhì)粒pBlue/HSA雙酶切的回收產(chǎn)物多出了約0.4 kb;經(jīng)EcoRI和N otI雙酶切得到長(zhǎng)度約2.2 kb的片斷和2.9 kb的載體片斷,而HSA的編碼序列為1.8 kb,證明成功構(gòu)建了HSA-IL2m的編碼基因。

3.2 表達(dá)載體pPHIm的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pPHIm物理圖譜如圖2(a)所示。融合基因插入表達(dá)載體pPIC9K的EcoRI和NotI位點(diǎn)之間,在序列上位于AOX1啟動(dòng)子和α交配因子的下游且與α交配因子的開放閱讀框相同。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPHIm的酶切鑒定見圖2(b),重組質(zhì)粒pPIHm經(jīng)EcoRI單酶切得到一條長(zhǎng)約11.4 kb的產(chǎn)物,經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切得到長(zhǎng)約2.2 kb的插入片斷和長(zhǎng)約9.3 kb的載體片斷,表明融合基因已經(jīng)成功插入到載體pPIC9k中。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示,全部序列沒有發(fā)生突變,與預(yù)期一致。

圖1 重組質(zhì)粒pBHIm的酶切分析Fig.1 Restriction analysis of the recombinant plasmid pBHIm

3.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選及誘導(dǎo)產(chǎn)物的Western blot鑒定

質(zhì)粒pPHIm經(jīng)S alI酶切,回收線性化片斷,電擊轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞。涂布MD平板,30℃培養(yǎng)4 d后共長(zhǎng)出了約400個(gè)轉(zhuǎn)化子,挑選其中200個(gè)菌落進(jìn)行初篩,選其中表達(dá)量較高的10株重組菌進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證,得到一株產(chǎn)量最高的重組菌P.pastorisGS115/pPHIm,誘導(dǎo)3 d后上清液的SDS-PAGE分析和Western blot結(jié)果如圖3所示。

圖2 重組質(zhì)粒pPHIm的物理圖譜(A)和酶切分析(B)Fig.2 Physical map(A)and restriction analysis(B)of the recombinant plasmid pPHIm

研究發(fā)現(xiàn),表達(dá)的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為82 000,與理論計(jì)算HSA-IL2m的相對(duì)分子質(zhì)量相符,且這一位置的蛋白與IL-2、HSA的抗體都能發(fā)生免疫反應(yīng),進(jìn)一步證實(shí)酵母經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)HSAIL2m。但70 000和45 000這兩處的降解條帶又都可以與HSA的抗體發(fā)生免疫反應(yīng),認(rèn)為是融合蛋白降解所產(chǎn)生的條帶。經(jīng)白蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)得其中白蛋白融合蛋白的量約為60.2 mg/L(以HSA-IL2m計(jì))。

3.4 誘導(dǎo)產(chǎn)物的活性測(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)脫鹽處理后,凍干保存。取0.1 mg凍干粉用2 mL PBS復(fù)溶后,離心取上清,測(cè)得其中融合蛋白的量約為300μg/mL。采用IL-2依賴細(xì)胞株CTLL-2以標(biāo)準(zhǔn)品IL-2為對(duì)照,對(duì)上清液中的融合蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行了測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品的活性為2×105IU/mL,用RPMI1640稀釋到濃度為200 IU/mL。測(cè)定結(jié)果表明,上清液中的融合蛋白可以有效的刺激CTLL-2細(xì)胞增殖。以標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度OD570值為100%,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品梯度百分率。將百分率換算為概率單位,以概率單位為縱坐標(biāo),以稀釋度X的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制直線回歸圖(圖4),通過(guò)計(jì)算得出融合蛋白粗蛋白的比活性為1.51×106IU/mg。

圖3 融合蛋白HSA-IL2m的SDS-PAGE分析(A)和Western Blot分析(B)Fig.3 SDS-PAGE(A)and Western Blot(B)of the fusion protein HSA-IL2m

圖4 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換與線性回歸的概率單位分析Fig.4 Probit unit analysis of transformation and linear regression of data

3.5 融合蛋白的搖瓶誘導(dǎo)條件初步優(yōu)化

3.5.1 初始p H對(duì)表達(dá)量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時(shí),將初始p H值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、

6.5,種子液培養(yǎng)36 h后,經(jīng)離心,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%甲醇,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測(cè)定其中融合蛋白的含量。結(jié)果如圖5(a)所示,該菌表達(dá)HSA-IL2m的最適初始p H都在6左右,由于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液,測(cè)得的發(fā)酵液p H也基本在初始p H附近,因此可基本確定該菌的最適p H在6.0附近,這與Invitrogen公司的介紹相符。

3.5.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)表達(dá)量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時(shí),將初始p H調(diào)至6,二級(jí)種子培養(yǎng)36 h后,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體, 200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積分?jǐn)?shù)補(bǔ)加1%,2%,3%,4%甲醇,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測(cè)定其中融合蛋白的含量。結(jié)果如圖5(b)所示,甲醇添加量為3%時(shí)HSA-IL2m的表達(dá)量最高。

3.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)表達(dá)量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時(shí),將初始p H調(diào)至6,二級(jí)種子培養(yǎng)36 h后,用相同體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,分別采用旋轉(zhuǎn)式搖床150、200、250 r/min,往復(fù)式搖床100、200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積補(bǔ)加甲醇3%,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測(cè)定其中HSA-IL2m的含量。結(jié)果如圖5(c)所示,100(W)、200(W)為往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速),在裝液量體積10%條件下,隨轉(zhuǎn)速上升,表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。相同轉(zhuǎn)速下往復(fù)式搖床的溶氧要高于旋轉(zhuǎn)式搖床,說(shuō)明畢赤酵母在誘導(dǎo)期間對(duì)溶氧的需求量非常大,由于搖床轉(zhuǎn)速的限制,確定最適的搖床轉(zhuǎn)速為往復(fù)式200 r/ min。

3.5.4 誘導(dǎo)相與生長(zhǎng)相培養(yǎng)基體積比對(duì)表達(dá)量的影響 配制BMMY培養(yǎng)基時(shí),將初始p H調(diào)至6,二級(jí)種子培養(yǎng)36 h后,用1∶1、1∶0.5、1∶0.3倍體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,分別采用往復(fù)式搖床200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h按體積補(bǔ)加甲醇3%,72 h后將發(fā)酵液離心并取上清,測(cè)定其中HSA-IL2m的含量。結(jié)果如圖5(d)所示,該菌在1:0.5這個(gè)濃縮倍數(shù)下,表達(dá)量較高,在有充分的溶氧和合理的培養(yǎng)基的組分的情況下,隨著細(xì)胞密度的增加,目的蛋白的表達(dá)量會(huì)逐漸增加。由于本文研究的是在搖床條件下表達(dá)目的蛋白,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定值的時(shí)候,溶氧就成了限制菌體代謝和目的蛋白表達(dá)的重要因素,所以研究細(xì)胞密度對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響是有必要的。

圖5 誘導(dǎo)條件對(duì)HSA-IL2m產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inducing conditions on HSA-IL2m yield

3.5.5 初步優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)配制BMMY培養(yǎng)基時(shí),將初始p H調(diào)至6,二級(jí)種子培養(yǎng)36 h后,用1:0.5倍體積的BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體,采用往復(fù)式搖床200 r/min,30℃培養(yǎng),每隔24 h補(bǔ)加3%甲醇,誘導(dǎo)5 d,其間每隔24 h取樣保存。結(jié)果如圖8所示,從發(fā)酵液SDSPAGE電泳來(lái)看,82 000處的條帶隨時(shí)間逐漸變深,誘導(dǎo)3 d以后該條帶基本不再變化,因此確定搖瓶誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為3 d。取3 d的樣品,測(cè)其中HSA-IL2m的質(zhì)量濃度為144 mg/L。

圖6 優(yōu)化誘導(dǎo)條件下P.pastorisGS115/pPHIm表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE of expressed product ofP.pastoris GS115/pPHIm under the optimized inducing condition

實(shí)驗(yàn)得到的表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量與HSAIL2m的理論預(yù)測(cè)值相符,Western blot發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物擁有HSA和IL2m,CTLL-2/MTT法提示表達(dá)產(chǎn)物具有IL-2生物學(xué)活性,說(shuō)明本研究的表達(dá)產(chǎn)物是HSA-IL2m。

根據(jù)密碼子的偏愛性,宿主細(xì)胞能夠以不同的速度合成所需要的蛋白質(zhì),需要量少的蛋白質(zhì)基因由于其中有些密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA含量少,因而合成較少,反之亦然,宿主以此來(lái)控制該蛋白質(zhì)的合成速度,這符合基因表達(dá)調(diào)控的規(guī)律。因此按照密碼子偏好,對(duì)外源基因編碼基因進(jìn)行定向改造可以有效提高外源蛋白的表達(dá)量[10]。

HSA是含有585個(gè)氨基酸殘基的單鏈無(wú)糖基化的球形蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量65 000,它是人血漿中含量最高的蛋白質(zhì)。HSA本身就是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體,藥物蛋白和HSA結(jié)合后,可以減少其藥物利用度同時(shí)增加在體內(nèi)的半衰期[11]。大多數(shù)治療用的蛋白和多肽半衰期一般較短,而HSA有將近長(zhǎng)達(dá)19 d的血清半衰期,并且HSA的基因在畢赤酵母中可以高效分泌表達(dá)[12],搖瓶發(fā)酵表達(dá)量可達(dá)390 mg/L,上罐發(fā)酵表達(dá)量可以達(dá)到4 g/L,搖瓶發(fā)酵上清液雜質(zhì)含量較少,純化方便,將藥物基因與HSA的基因融合,在畢赤酵母中表達(dá),獲得融合蛋白,延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物的半衰期。

4 結(jié) 語(yǔ)

將IL2m的編碼基因直接融合于HSA的編碼序列的C端,中間沒有加入任何連接肽。突變型融合蛋白在畢赤酵母中得到了分泌表達(dá),有輕微降解。所表達(dá)的HSA-IL2m可以有效刺激CTLL-2細(xì)胞的增殖,表現(xiàn)較高的生物學(xué)活性。

[1]Kim HP,Imbert J,Leonard W.Both integrated and differential regulation of components of the IL-2/IL-2 receptor system [J].Cytokine G rowth Factor Rev,2006,17(5):349-366.

[2]常志遠(yuǎn),徐荻.白細(xì)胞介素2的研究進(jìn)展[J].中國(guó)處方藥,2004,29:36-38.

CHANG Zhi-yuan,XU Di.Advances in Interleukin-2[J].China Prescription Drug,2004,29:36-38.(in Chinese)

[3]蔣春雷,徐荻,鄭仲承,等.白細(xì)胞介素-2的中樞鎮(zhèn)痛作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,1994,10(4):322-324.

J IANG Chun-lei,XU Di,ZHENG Zhong-cheng,et al.The central analgesic effect of IL-2[J].Chinese Journal of Applied Physiology,1994,10(4):322-324.(in Chinese)

[4]Alice KP,Jorge AT.Therapeutic use of interleukin-2 in HIV-infected patients[J].Current Opinion In Pharmacology, 2002,2:433-439.

[5]Grace Ju,Lisa C,Kimberlee L,et al.Structure-Function analysis of human interleukin-2[J].The journal of Biological Chemistry,1994,262(12):5723-5731.

[6]李潔,張蓮芬,孫均銘,等.人C-型利鈉肽-血清白蛋白融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建及在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J].中國(guó)生化藥物雜志,2007,28(5):289-293.

LI Jie,ZHANGLian-fen,SUN Jun-ming,et al.Secretive expression of the fusion protein HSA-CNP inPichia pastoris[J].Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics,2007,28(5):289-293.(in Chinese)

[7]Version E,Carlsbad CA.Multi-copy Pichia Expression Kit.Invitrogen,1999.

[8]周道洪,沈元珊,趙曼瑞.測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和鼠白細(xì)胞介素2活性的新方法——MTT比色分析法[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,1986,2(1):39-44.

ZHOU Dao-hong,SHEN Yuan-shan,ZHAO Man-rut.The application of MTT colorimetric assay to measured the proliferation of lymphocytes and the activity of rat/mouse IL2[J].Chinese Journal of Immunology,1986,2(1):39-44.(in Chinese)

[9]Samrook J,Pritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual[J].Analytical Biochemistry,1990,186:182 -183.

[10]Scorer CA,Buckholz RG,Clare JJ,et al.The intracellular production and secretion of HIV-envelope protein in the methylotropic yeastPichia pastoris[J].G ene,1993,136:111-119.

[11]Roberts M J,Bentley MD,Harris JM,et al.Chemistry for peptide and protein PEGylation[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2002,54(4):459-476.

[12]郭美錦,莊英萍,儲(chǔ)炬,等.重組巴氏畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)rHSA[J].微生物學(xué)報(bào),2002,42(1):65-68.

GUO Mei-jin,ZHUANG Ying-ping,CHU Ju,et al.Expression of recombinant human serum albumin in genetically engineered pichia pastoris in high-density fermentation[J].Acta Microbiologica Sinica,2002,42(1):65-68.(in Chinese)

(責(zé)任編輯:朱明)

Expression of the Fusion Protein Human Serum Album/Mutant Human Interleukin 2C125A inPichia pastoris

J IN Guang-ze1, DUAN Zu-ying1, ZHANG Lian-fen2, J IN Jian2, LI Hua-zhong＊1
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Wuxi 214122,China;2.School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study was to obtain the fusion protein HSA-IL2m with high IL2 bioactivity,for this,the recombinant plasmid encoding HSA-IL2C125A was constructed and expressed inPichia pastorisGS115.The DNA fragment encoding mutant IL-2 of C125A was design and synthesized based on codon usage bias ofP.pastoris.The fragment was spliced with Human Serum Album encoding gene and then the fusion gene was cloned into pPIC9K to construct the expression plasmid pPHIm by restrictive digestion and ligation.Recombinant yeast ofP.pastorisGS115/pPHIm was obtained with pPHIm linearization and electroporation.The excreting product was obtained under shake flask culture.Results:Western-blot showed the fusion protein reactive positively with the antibody of IL-2 and HSA,respectively.The crude fusion protein prepared by desalting and freeze-drying showed IL-2 bioactivity of 5.0 105IU/mg. The results demonstrated that the fusion protein ofHSA-IL2m with IL-2 bioactivity wassuccessfully expressed inP.pastorisGS115.

mutant Human interleukin-2,Human serum album,Pichia pastoris,fusion protein

Q 81

:A

1673-1689(2010)04-0595-07

2009-09-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30970029);江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金計(jì)劃項(xiàng)目(BY2009110)。

＊通信作者:李華鐘(1958-),男,山東龍口人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事微生物制藥研究。Email:hzhli@jiangnan.edu.cn