黃惠莉, 肖易, 殷果

(華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建廈門(mén) 361021)

一株具有拮抗作用的海洋放線菌篩選及其特性

黃惠莉, 肖易, 殷果

(華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建廈門(mén) 361021)

為了探尋對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有拮抗作用效果的海洋微生物新菌種,作者采用平板稀釋方法,經(jīng)初篩與復(fù)篩從海洋淤泥中分離得到一株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好拮抗作用效果的海洋微生物菌L菌株,并對(duì)該菌的生理生化特性、發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的變化及抑菌效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:海洋微生物菌L菌經(jīng)初步判斷屬放線菌,L菌適宜的發(fā)酵時(shí)間為9～10 d,產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的拮抗作用。

海洋微生物;次生代謝產(chǎn)物;抑菌率

近年來(lái)海洋微生物活性物質(zhì)開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展迅速,世界已發(fā)現(xiàn)的微生物約有150多萬(wàn)種,其中72 000種存在于陸地,其余都存在于海洋之中。據(jù)報(bào)道,最近美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在一些地方,每平方英尺的海泥上就能找到10多種尚未被人類所認(rèn)識(shí)的海洋微生物,這些海洋微生物有產(chǎn)生多種多樣新穎生物活性物質(zhì)的巨大潛力,是海洋微生物天然藥物篩選的重要來(lái)源[1-7]。生活環(huán)境的不同,不但影響菌群的分布,而且影響微生物代謝產(chǎn)物的合成。海洋微生物獨(dú)特的生長(zhǎng)和代謝方式,有可能產(chǎn)生比陸生微生物結(jié)構(gòu)更新、活性更高、功能更具獨(dú)特的抗菌活性物質(zhì)。有關(guān)海洋生物產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)的報(bào)道逐漸增多,已經(jīng)從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的化合物,這些化合物具有較高的抗腫瘤活性[8]。海洋放線菌是海洋細(xì)菌抗腫瘤活性物質(zhì)的重要來(lái)源,最先成為海洋微生物研究的熱點(diǎn)。國(guó)際最著名的海洋天然產(chǎn)物研究機(jī)構(gòu)——加州大學(xué)從放線菌中分離出一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物,這些化合物具有很強(qiáng)的抗癌活性,從報(bào)道化合物的結(jié)構(gòu)類型來(lái)看,有生物堿、環(huán)肽、聚醚類毒素、萜類等[9-12]。海洋放線菌因其代謝途徑復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類繁多而日益受到研究者的重視。

因此,對(duì)海洋微生物的研究已經(jīng)成為了具有很大發(fā)展前景的科研方向,為尋求新的藥物或抑菌物質(zhì),作者通過(guò)對(duì)福建泉州海岸微生物中海洋放線菌的篩選、觀察、抑菌性研究和發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定,來(lái)了解海洋放線菌在一定條件下的代謝產(chǎn)物的抑菌率,以便進(jìn)一步的對(duì)其開(kāi)發(fā)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 從福建省泉港海邊的海洋淤泥中分離提取。

1.1.2 供試菌 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選

1)初篩:為尋求對(duì)供試菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)具有一定拮抗作用的海洋微生物[12],采用微生物稀釋法將海泥稀釋,接種在選擇性培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基中添加適量重鉻酸鉀抑制劑)中分離培養(yǎng),在25℃下倒置培養(yǎng)5～7 d后,挑取單菌落進(jìn)行純化、復(fù)篩。

2)復(fù)篩:以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌做為供試菌,將等量的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)與待測(cè)菌的發(fā)酵液混合培養(yǎng)一定時(shí)間,觀察其生長(zhǎng)情況。選出對(duì)供試菌具有一定抑制作用且較為單一的菌落,進(jìn)行劃線分離培養(yǎng),反復(fù)多次純化,在25℃下倒置培養(yǎng)5～7 d后,挑取單菌落接種斜面保存。

3)菌種形態(tài)觀察:將篩選出的具有抑菌作用的放線菌L菌進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用濁度法測(cè)定抑菌性。將等量的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供試菌與待測(cè)菌發(fā)酵液混合培養(yǎng)一定時(shí)間,測(cè)定其濁度為N1,并以加入滅活的等量發(fā)酵液后培養(yǎng)相同時(shí)間的供試菌菌液做空白,測(cè)定其濁度為N2,計(jì)算其抑菌率。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn) 生理生化實(shí)驗(yàn)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11,13]。

1.2.4 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的測(cè)量

1)還原糖質(zhì)量濃度測(cè)定:采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖質(zhì)量濃度。

2)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定:采用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[12]。

3)發(fā)酵過(guò)程中p H值的測(cè)定:直接用p H測(cè)試儀測(cè)定每瓶發(fā)酵液的p H值,記錄后繪制p H值變化曲線。

4)細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)定:將每天離心后所得的沉淀物取出,進(jìn)行烘干,烘至恒質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 海洋放線菌的篩選與分離

2.1.1 初篩 選擇適合于待分離的微生物的生長(zhǎng)條件,經(jīng)涂布法分離初篩得到17種(用A～Q標(biāo)記)不同的菌落形態(tài)微生物,觀察到的菌落形態(tài)見(jiàn)表1。

表1 初篩觀察到的菌落形態(tài)Tab.1 Shape of the screened marine microorganisms

續(xù)表1

2.1.2 復(fù)篩 依據(jù)上述復(fù)篩實(shí)驗(yàn)方法,將等量的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)與待測(cè)菌發(fā)酵液混合培養(yǎng)一定時(shí)間,測(cè)定其濁度計(jì)算其抑菌率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 待測(cè)菌發(fā)酵液對(duì)供試菌的抑菌率Tab.2 Anti-microbial ratio of the marine microorganism

所挑選出來(lái)的菌種中這7種海洋微生物對(duì)大腸桿菌供試菌具有一定的拮抗作用,但是僅4種菌對(duì)金黃色葡萄球菌具有拮抗作用。

2.1.3 菌種的電鏡觀察 在分離純化的7種有抑菌效果的海洋微生物中,選出了抑菌效果較好的L菌進(jìn)行電鏡觀察,結(jié)果見(jiàn)圖1。

從電鏡形態(tài)觀察可以看出,該菌有菌絲,且錯(cuò)縱復(fù)雜。因?yàn)橛墟咦?卻無(wú)分生孢子梗,初步判斷屬放線菌。

2.2 海洋微生物菌的生理生化檢測(cè)

分別對(duì)C、J、K、L、N、F、H菌進(jìn)行生理生化測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表3。

這些海洋微生物菌的糖酵解試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)都呈陽(yáng)性,即都可以消耗糖類,并都可以使明膠液化。而V-P試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)均為陰性,這幾種微生物菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣但不產(chǎn)H2S,在強(qiáng)堿環(huán)境下,不能被空氣中的氧氣氧化為二乙酰。

圖1 L菌形態(tài)與菌孢子形態(tài)Fig.1 The shape of marine actinomycete and their spore

表3 海洋微生物菌的生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristic of the screened marine microorganism

2.3 海洋放線菌L菌的發(fā)酵參數(shù)變化

依據(jù)上述1.2.4實(shí)驗(yàn)方法,每天取出一瓶發(fā)酵過(guò)程中的L菌發(fā)酵液,冷凍離心分離得到上清液與菌體,將菌體烘干至恒重后稱其質(zhì)量;并測(cè)定上清液中的p H值、葡萄糖、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可知:該菌的菌體干重在搖床培養(yǎng)到第5天時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài),然后出現(xiàn)波動(dòng),這表明菌體經(jīng)生長(zhǎng)旺盛期后達(dá)到最高峰并進(jìn)入平穩(wěn)期,在持續(xù)較長(zhǎng)的平穩(wěn)期生長(zhǎng)中,細(xì)胞質(zhì)量變化相對(duì)較小。

從圖2的葡萄糖質(zhì)量濃度變化曲線可以看出,該海洋放線菌在搖床發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)是一個(gè)消耗葡萄糖的過(guò)程,葡萄糖的質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)。在第5天時(shí),培養(yǎng)基中的葡萄糖已經(jīng)耗盡,此時(shí)菌體干重達(dá)到最高。

圖2 L菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵各參數(shù)的變化Fig.2 The change of fermentation parameters during fermentation time

從圖2可以看出,搖床發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度總體呈上升趨勢(shì)。前期蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度變化有波動(dòng)但變化不大。根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的變化,可以確定在第10～14天,L菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物含蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

p H值的變化是在前4天有下降趨勢(shì),后面穩(wěn)定上升,到第10天后趨于平穩(wěn)。說(shuō)明前4天代謝產(chǎn)物含產(chǎn)酸性物質(zhì),到第5天后次生代謝產(chǎn)物含堿性物質(zhì),第10天后p H值趨于穩(wěn)定。

綜合p H值、菌體干重、葡萄糖質(zhì)量濃度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度來(lái)看,從第10天開(kāi)始產(chǎn)生的是蛋白質(zhì)類的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

2.4 L菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)海洋放線菌L菌在搖床培養(yǎng)中的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中知:L菌的發(fā)酵液從第9天開(kāi)始,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較好的抑菌能力。

圖3 L菌發(fā)酵液的抑菌能力Fig.3 The anti-microbial effect of fermentation product

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)海洋微生物的分離、抑菌性實(shí)驗(yàn),得到具有較好拮抗作用效果的L菌,了解L菌的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的變化,L菌產(chǎn)生具有拮抗作用的活性物質(zhì)的適宜發(fā)酵時(shí)間是9～10 d,該發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌能力。

對(duì)該菌通過(guò)發(fā)酵調(diào)控提高發(fā)酵產(chǎn)物活性穩(wěn)定性、純化分離其活性物質(zhì)、確定其具體成分與結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Characteristic of Marine Actinomycete Having Antagonistic Effects

HUAN G Hui-li, XIAO Yi, YIN Guo
(Chemical Engineering College,Huaqiao University,Xiamen 361021,China)

The purpose of this manuscript is to screen the marine microorganisms and evaluate the antagonistic effects of those isolated microorganism toEscherichia coliand theStaphylococcus. A isolated marine microorganism L having better antagonism effects was separated from the dilutedmarinemud.Physiologyandbiochemicalcharacteristicsoftheisolatedmarine microorganism,the curve of fermentation control parameters were studied.Antagonism effects of the ferment production were tested with theEscherichia coliand theStaphylococcus.The result shows that marine microorganism L was marine actinomycetes,the suitable fermentation time is 9 to10 days,the secondary metabolite in fermentation broth have certainty the antagonism ability toEscherichia coliandStaphylococcus.

marine microorganism,secondary metabolite,anti-microbial ratio

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0471-05

2009-07-06

福建省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2007T010)。

黃惠莉(1962-),女,福建詔安人,工學(xué)學(xué)士,教授,主要從事海洋資源開(kāi)發(fā)與利用、環(huán)境生物技術(shù)方面的研究。Email:hlhuang@hqu.edu.cn。