姜海榮, 倪永清, 宋麗軍, 尹琳琳, 江英, 陳計(jì)巒

(新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832003)

新鮮哈密瓜汁中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

姜海榮, 倪永清, 宋麗軍, 尹琳琳, 江英, 陳計(jì)巒＊

(新疆石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832003)

采用稀釋平板法從新鮮哈密瓜汁中分離出48株可培養(yǎng)細(xì)菌,通過傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定,將其歸為10個(gè)類群。利用細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增10個(gè)類群代表菌株的16S rRNA基因,并進(jìn)行序列測定。將獲得的序列通過Blast在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)菌株的同源性序列,采用Clustal1.81軟件比對(duì),用Mega 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合表型特征研究表明,新鮮哈密瓜汁中可培養(yǎng)細(xì)菌以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢微生物類群,主要為枯草芽孢桿菌B acillus subtilis,其次為地衣芽孢桿菌B acillus lichenif ormis、蘇云金芽孢桿菌B acillus mojavensis。此外還有銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋蔥伯克霍爾德氏菌B urkholderia cepaciastrain、鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii,以及腸球菌屬Enterococcussp、克雷伯氏菌屬Klebsiellasp的菌株。

新鮮哈密瓜汁;可培養(yǎng)細(xì)菌;16S rDNA;序列分析;系統(tǒng)發(fā)育分析

新疆哈密瓜風(fēng)味獨(dú)特、富含多種營養(yǎng)物質(zhì),其果汁為金黃色,處于均勻的混合狀態(tài),是一種很有市場潛力的果汁。但哈密瓜是熱敏性瓜果,采用傳統(tǒng)的高溫殺菌,將使哈密瓜汁產(chǎn)生不良的蒸煮味,且失去大量營養(yǎng)物質(zhì),因此對(duì)于熱敏性的果蔬汁多采用非熱力殺菌模式。研究表明[1],引起果汁腐敗變質(zhì)的因素很多,如微生物、酶類等,但是引起新鮮果汁腐敗變質(zhì)的主要因素是微生物污染。

為了選擇合適的殺菌方式,更有效地控制哈密瓜汁中微生物,就必須首先了解哈密瓜汁中的常見微生物的種類、特性和數(shù)量分布狀況,然后才能有針對(duì)性地選擇適宜的殺菌方法和殺菌工藝。因此對(duì)新鮮哈密瓜汁中的微生物種類進(jìn)行分離和鑒定,對(duì)如何控制新鮮哈密瓜汁中微生物具有非常重要的意義。

果汁中的微生物菌群相對(duì)復(fù)雜,按照傳統(tǒng)的以形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)為基礎(chǔ)的細(xì)菌檢測和分類方法較為繁瑣。目前隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,采用16S rRNA基因鑒定未知菌更加方便、快捷、高效。因此16S rRNA已經(jīng)成為細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最常用也是最有效的分子指標(biāo),被廣泛地應(yīng)用于各種微生物的遺傳特性和分子差異的研究[2]。作者在研究新鮮哈密瓜汁中的可培養(yǎng)細(xì)菌基本生長特性的基礎(chǔ)上,采用細(xì)菌通用引物對(duì)分離菌株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增和快速鑒定,以確定哈密瓜汁中微生物類群的多樣性,為哈密瓜汁的有效殺菌和貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及儀器設(shè)備

1.1.1 材料 新疆哈密瓜,品種為伽師瓜86-1,產(chǎn)于新疆喀什市,其新鮮哈密瓜汁p H值為6.55。

1.1.2 菌種 分離自新鮮哈密瓜汁中的可培養(yǎng)細(xì)菌。

1.1.3 儀器設(shè)備 SW-CJ-100型超凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)安泰公司制造;DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造;SPX-250B-2型生化培養(yǎng)箱:上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司制造;TC-512型PCR儀:Barloworld公司制造;Gel DoxTMXR 170-8170型凝膠成像系統(tǒng):Blo-RAD公司制造。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB固體培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,瓊脂17 g,調(diào)p H 7.0,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂17 g,調(diào)p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 營養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基(NB) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,調(diào)p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高壓滅菌20 min。

1.3 細(xì)菌的分離、純化及保存

100個(gè)哈密瓜隨機(jī)分為5組,每組隨機(jī)選取一個(gè),瓜體表面經(jīng)過酒精消毒,去皮去瓤,在無菌超凈臺(tái)將哈密瓜切成1 cm小塊放入無菌培養(yǎng)皿,再用無菌玻板搗碎,靜置10 min,吸取1 mL新鮮瓜汁接入9 mL無菌生理鹽水,即得10-1濃度菌懸液,依次類推,分別制取10-2、10-3濃度菌懸液。稀釋平板法分離哈密瓜汁中可培養(yǎng)細(xì)菌。

取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間而且菌落之間分離生長較好的平皿,無菌操作挑選不同形態(tài)和顏色的菌落,在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離,將此平皿置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2～4 d,挑取的菌落經(jīng)3～5次的平板劃線分離后,如果菌落形態(tài)、顏色較一致,則進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢,經(jīng)過分離得到的單菌落進(jìn)行涂片和簡單結(jié)晶紫染色,在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察觀察其形態(tài)和純度[3],不純的菌落用平板稀釋法進(jìn)行純化,分離純化后在4～6℃下保存。另一份純化后的單菌落接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)培養(yǎng)基,37℃搖床培養(yǎng)后加入體積分?jǐn)?shù)15%的甘油,于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.4 革蘭氏染色和鏡檢

取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片,用結(jié)晶紫進(jìn)行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇脫色,最后用番紅復(fù)染。在顯微鏡下觀察個(gè)體形態(tài)特征,如果發(fā)現(xiàn)還有雜菌,則繼續(xù)進(jìn)行平板劃線分離,直至鏡檢個(gè)體形態(tài)特征一致。鏡檢中細(xì)胞保留藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌,細(xì)胞為紅色的細(xì)菌為革蘭氏陰性。

1.5 芽孢檢測

分離出的菌株分別編號(hào)為s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2,接種到NA平板上,30℃培養(yǎng)3～7 d,顯微鏡觀察是否有芽孢形成。

1.6 生長溫度范圍和pH值范圍的測定

分離的菌株編號(hào)為s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2。

1.6.1 生長溫度范圍 為準(zhǔn)確測定溫度范圍[4],采用下面兩個(gè)步驟:

1)粗測:首先將以上編號(hào)的菌懸液以涂布法涂布在p H為7.0的NA培養(yǎng)基平板上,將平板分別在溫度為20、30、40、50、60、70℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h后觀察菌落生成情況,初步確定各菌生長溫度范圍。

2)精測:確定大致范圍,再將以上編號(hào)的菌懸液以涂布法涂布在p H為7.2的NA培養(yǎng)基平板上,使其溫度值在粗測的范圍內(nèi)精確到0.1,將平板分別在不同的溫度下恒溫培養(yǎng)48 h,觀察菌落生成情況,最終確定各菌生長溫度范圍。

1.6.2 不同菌生長p H值范圍的確定

1)粗測:分別采用1%的稀硫酸,1%的氫氧化鈉溶液來調(diào)整NA培養(yǎng)基的p H值,使其p H值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,將不同編號(hào)菌懸液以涂布法分別涂布在不同p H值的NA培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)48 h后觀察菌落生成情況,初步確定耐熱菌的生長p H值范圍。

2)精測:經(jīng)初步確定,將耐熱菌菌懸液以涂布法分別涂布在不同p H值的NA培養(yǎng)基上,使其p H值在粗測的范圍內(nèi)精確到0.1,37℃下培養(yǎng)48 h后觀察菌落生成情況,最終確定不同菌的生長p H值范圍。

1.7 細(xì)菌菌株的16S rDNA鑒定

1.7.1 細(xì)菌培養(yǎng)及染色體DNA制備 接種單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。然后取1 mL培養(yǎng)液接入100 mL LB培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h,5 000 r/min離心15 min,棄上清液,加入無菌水離心洗滌,棄上清液,再加入10 mL TE離心洗滌,棄上清液,加入10 mL TE溶解菌體,混勻于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取0.5 mL菌懸液加入30μL SDS混勻,加入10μL 20 mg/mL蛋白酶K,10μL溶菌酶,37℃混勻溫育1 h。加入100μL、5 mol/L NaCl,再加入80μL CTAB/NaCl溶液混勻,65℃溫育10 min,加入等體積V酚∶V氯仿∶V異戊醇為25∶24∶1,混勻于12 000 r/min離心5 min,保留上清液,上清液中加入等體積V酚∶V氯仿∶V異戊醇為25∶24∶1混勻, 12 000 r/min離心5 min,保留上清液,上清液中加入氯仿/異戊醇,12 000 r/min離心5 min,保留上清液。上清液中加入無水乙醇和醋酸鈉,輕輕混合直到DNA沉淀下來,冷藏過夜,12 000 r/min離心5 min,收集沉淀,用70%乙醇離心洗滌沉淀,用1 mL TE溶解DNA,加入20μg/mL RnaseA于4℃保存。

DNA電泳檢測:用1 g/dL瓊脂糖凝膠(含核酸染液),每孔點(diǎn)樣6μL(5μL樣品+1μL loading butter),電泳為100 V/h。

1.7.2 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化目前根據(jù)大腸桿菌的基因組序列設(shè)計(jì)出了多對(duì)用于16S rDNA序列擴(kuò)增的引物。作者選擇引物為27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3對(duì)應(yīng)于E.coli16S rDNA的8～27位和1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3,對(duì)應(yīng)于E.coli16S rDNA的1 525～1 542位進(jìn)行擴(kuò)增,該對(duì)引物能夠擴(kuò)增出近乎全長的16S rDNA序列,長度約為1 500 bp。

50μL16S rDNA-PCR的反應(yīng)體系:16S rDNAPCR的反應(yīng)體系:10×的Taq Buffer 5μL,2.5 mmol/L dNTP 4μL,2.5 U Taq酶0.2μL,0.4 μmol/L的引物1μL,模板約500 ng/μL,2 mmol/L MgCl24μL,使用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至50μL。

熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為:95℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,55℃復(fù)性1 min,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。取3～5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1 g/dL的瓊脂糖凝膠上電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.7.3 PCR產(chǎn)物的測序及結(jié)果分析 PCR產(chǎn)物通過切膠純化,樣品送至上海生工公司雙向測序,將拼接后的測序結(jié)果輸入http://www.ncbi.nlm. nih.gov/,通過互聯(lián)網(wǎng),將測得的基因序列,通過Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性較高的相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析。

序列的比較及系統(tǒng)發(fā)育分析采用Clustalx1.81軟件與GenBank基因序列作最大同源性比較分析,并利用Mega 4.1軟件以N-J法(neighbor-joining)作系統(tǒng)樹,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S的rDNA-PCR產(chǎn)物純化電泳檢測

PCR產(chǎn)物純化,經(jīng)電泳后利用小源凝膠成像系統(tǒng)成像,見圖1。與Maker條帶比較,可知目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度大約為1 500 bp。圖1標(biāo)號(hào)為1～10,分別為s-5-2、B-1、s-4、s-5-1、A-1、AAM-1、AAM-2、S-2、s-3、B-2的16S rDNA-PCR產(chǎn)物純化電泳圖。

圖1 不同分離自新鮮哈密瓜汁中菌株16SrDNA-PCR產(chǎn)物純化電泳圖譜Fig.1 Diagram of Agarose gel electrophoresis of strains isolated from freah H ami-melon juice by 16S rDNA-PCR

2.2 形態(tài)特征、基本生長特征及序列分析

不同編號(hào)菌株的形態(tài)特征、基本生長特征及序列分析結(jié)果見表1。

根據(jù)與Genebank中已有的核酸序列比較結(jié)果,除s-3和B-2菌株外,其余8株菌與數(shù)據(jù)庫中同一種的細(xì)菌同源性均大于99%。一般認(rèn)為,16S rDNA序列同源性小于98%,可以認(rèn)為屬于不同的種,同源性小于93%～95%,可以認(rèn)為屬于不同屬[5]。因此s-5-2、s-4、B-1可以確定為枯草芽孢桿菌B acillus subtilis,AAM-1可以確定為銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosastrain,AAM-2可以確定為洋蔥伯克霍爾德氏力B urkholderia cepacia,S-2可以確定為鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumanniistrain,A-1可以確定為蘇云氏芽孢桿菌B acillus mojavensisstrain,s-5-1可以確定為地衣芽孢桿菌B acillus lichenif ormisstrain,s-3和B-2分別可以確定為腸球菌屬Enterococcus和克雷伯氏菌屬Klebsiella。其中s-3與糞腸球菌同源性高達(dá)97%,有可能與其是一個(gè)種。B-2可能屬于克雷伯氏菌屬的某個(gè)新種。

2.3 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將各代表菌株和應(yīng)用Blast檢索到的與之有較高同源性菌株的16S rDNA序列利用Clustalx1.81軟件與GenBank基因序列作最大同源性比較分析,并利用Mega 4.1軟件以N-J法(neighbor-joining)作系統(tǒng)樹,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。在圖2中,A-1、s-5-1、s-5-2、B-1、s-4親緣關(guān)系非常近,與s-3較近,基本屬于同一屬的范圍內(nèi),而與AAM-1,AAM-2,S-2,B-2親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)。

圖2 新鮮哈密瓜汁中分離菌株序列系統(tǒng)發(fā)育分析(NJ)Fig.2 Neighbor-joing tree constructed showing the phylogenetic relationships among 16SrRNA gene sequences of isolated from H ami-melon juice.The scale bar represent 0.05 substitution

3 討 論

基于當(dāng)今分子生物學(xué)技術(shù)迅速的發(fā)展,越來越多的研究者開始使用16S rDNA序列分析方法[6]。作者采用傳統(tǒng)方法將所有分離到的菌株作初步的形態(tài)觀察和生理學(xué)檢測,將分離到的48株菌分為10個(gè)類群,應(yīng)用16S rDNA作為分子指標(biāo),擴(kuò)增出未知菌的16S rDNA,純化測序,測序結(jié)果在Genbank中用Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),從哈密瓜汁分離的不同菌株,大部分與已知菌都有很高的同源性,且能達(dá)到鑒定種的水平,很少可能有新種。

作者從新鮮哈密瓜汁中分離的48株可培養(yǎng)細(xì)菌,其中分離芽胞菌比例最大,占分離菌株的60%,為哈密瓜汁中主要的菌群。芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,在缺氧或不利條件下形成芽胞,是食品中常見的一種污染菌,在傳統(tǒng)的發(fā)酵制品中污染幾率更大[7]。一般而言,耐熱的細(xì)菌同樣耐壓,枯草芽胞桿菌比嗜熱脂肪芽胞桿菌(B acillus stearothemophilus)更耐壓[8-9]。陳世瓊等[10]人對(duì)蘋果汁中酸耐熱菌的分離鑒定為蘋果汁的非熱力殺菌技術(shù)提供了研究方向。

由于芽胞菌為哈密瓜汁中主要的菌群,在選擇哈密瓜汁殺菌方式時(shí),應(yīng)考慮該菌群的殺滅程度對(duì)果汁品質(zhì)本身可能造成的影響,因此該研究可為后續(xù)研究超高壓處理哈密瓜汁的殺菌工藝提供更為可靠的依據(jù)。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Identification and Phylogenesis Analysis of Cultivable Microorganism Isolated from Fresh Hami-Melon Juice

J IANG Hai-rong, NI Yong-qing, SONG Li-jun, YIN Lin-lin,
J IANG Ying, CHEN Ji-luan＊
(College of Food Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Forty-eight strains were isolated from the fresh hami melon juice using the dilution plate method.Those isolated strains divided into ten groups according to the morphological features. Then the 16S rDNA sequences were performed by employing the universal prime bacterial for polymerase chain reaction(PCR)amplification.The alignment search was performed with BLAST and GenBank databases,then compared this sequences using the software of Clastal1. 81,the phylogenetic tree was built using Mega 4.1 software.From the phylogenetic tree,it could be concluded thatB acillus subtilisis the main cultivated bacteria in the fresh hami melon juice and the following isB acillus lichenif ormis,B acillus mojavensis,Pseudomonas aeruginosastrain RE7,B urkholderia cepaciastrain ATCC 21809,Acinetobacter baumannii,andEnterococcussp,Klebsiellasp.

fresh hami melon juice,cultivate bacteria,16S rDNA,sequence analysis,phylogenetic

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0426-06

2009-09-07

教育部重點(diǎn)項(xiàng)目(207137);兵團(tuán)博士基金項(xiàng)目(2007jc11);國際科技合作項(xiàng)目(2009DFA32160)。

＊通信作者:陳計(jì)巒(1973-),女,新疆石河子人,工學(xué)博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究。Email:chenjiluan@163.com。